ОЦЕНКА МЕТАБОЛИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ КИШЕЧНОЙ МИКРОБИОТЫ И ЧАСТОТЫ СЕНСИБИЛИЗАЦИИ ПРИ РАЗЛИЧНЫХ ВИДАХ ВСКАРМЛИВАНИЯ У ЗДОРОВЫХ ДЕТЕЙ РАННЕГО ВОЗРАСТА

Многочисленные исследования указывают на то, что нарушение колонизационной резистентности кишечника ребенка, связанное с изменением состава постоянной микрофлоры, способствует росту патогенных и условнопатогенных бактерий, нарушению основных функций, что приводит к формированию кишечного дисбиоза и появлению риска развития пищевой аллергии [1-3]. Возникающие при этом нарушения вызывают повреждения пищеварительного барьера слизистой оболочки желудочно-кишечного тракта, что сопровождается снижением продукции секреторного IgA и способствует повышенному накоплению гистамина, кининов, противовоспалительных цитокинов. Эти процессы приводят к увеличению проницаемости слизистой оболочки для аллергенов и их усиленному всасыванию, что является одним из значимых пусковых механизмов сенсибилизации. Установлено, что Bifidobacterium lactis и Lactobacillus johnsonii могут индуцировать оральную толерантность, которая  зависит  от переваривания в желудочно-кишечном тракте и обработки антигена [4]. Существуют данные об участии пробиотиков в разрушении антигена в кишечнике, способности уменьшать интестинальную проницаемость (предупреждая проникновение аллергенов), стимулировать синтез IgA[5-8]. Однако неоспоримым остается тот факт, что только грудное вскармливание способствует колонизации кишечника новорожденных и грудных детей бифидодоминантной микрофлорой. Этот эффект в том числе обеспечивается олигосахаридами грудного молока - пребиотиками, которые не расщепляются в верхних отделах желудочно-кишечного тракта и стимулируют рост бифидобактерий в толстом кишечнике [9].

Одним из основополагающих факторов, влияющих на появление аллергических заболеваний, является характер вскармливания новорожденного ребенка. При невозможности питания грудным молоком используются адаптированные формулы на основе белков коровьего или козьего молока, обеспечивающих адекватный рост и развитие младенцев. Известно, что белок коровьего молока является одним из первых аллергенов, с которым сталкивается грудной ребенок [10,11]. Доказано, что белки коровьего молока устойчивы к протеолизу в кишечнике, чем и объясняется их высокая аллергенность. Устойчивость β-лактоглобулина для пищеварительных ферментов составляет 60 мин, других белковых фракций- около 8 мин, для сравнения, расщепление растительных белков занимает около 15 сек [12].

В последнее время были проведены исследования, доказывающие гипоаллергенные свойства козьего молока, которое отличается от коровьего по составу сывороточных белков, содержанию казеиновых фракций и, как результат, по иммунологическим свойствам [13-17]. Существующие немногочисленные публикации об аллергенности козьего молока противоречивы и касаются в основном цельномолочных продуктов на основе козьего молока – высококазеиновых козьих сыров [18]. До настоящего времени сведений о сенсибилизации и частоте аллергических реакций у здоровых детей при употреблении адаптированных смесей на основе цельного козьего молока в доступной литературе нет.

Целью работы явилась оценка влияния вида вскармливания на формирование функциональной активности кишечной микробиоты и пищевой сенсибилизации к белкам коровьего и козьего молока у детей первого года жизни.

Характеристика детей и методы исследования

Под наблюдением находились 200 практически здоровых детей обоих полов (129 мальчиков и 71 девочка) в возрасте от 2 мес. до 1 г. Наблюдение за детьми проводилось в городской поликлинике № 219 г.Москвы. В зависимости от характера вскармливания были выделены 100 детей на искусственном вскармливании (основная группа) и 100 младенцев на естественном вскармливании (группа сравнения). Дети на искусственном вскармливании в зависимости от вида получаемой смеси были разделены на 2 подгруппы. В 1-ю подгруппу входили дети, получавшие казеиндоминирующие формулы на основе цельного козьего молока с пребиотиками (51 ребенок), во 2-ю подгруппу были включены дети, получавшие смеси на основе сывороточных белков коровьего молока с пребиотиками (49 детей). Отягощенный по аллергии анамнез у детей, как на искусственном, так и на естественном вскармливании встречался с одинаково высокой частотой в 73,7% и 74% случаев соответственно. Частота аллергических заболеваний у матерей также была одинаковой в обеих группах младенцев (41,2% и 41% соответственно), аллергические заболевания у отцов имели место у 26,3% детей основной группы и у 15% в группе сравнения, болели оба родителя у 9,4% в основной группе и 19% младенцев в группе сравнения.

В 1-й подгруппе патологическое течение беременности было у 11 женщин (61,1%), во 2-й– у 16 (55,2%), в группе сравнения (естественное вскармливание) – у 21 (47,7%) женщины. Патологическое течение родов имело место у 3 (16,6%) матерей 1-й подгруппы детей, у 4 (13,7%) - из 2-й подгруппы и у 5 (11,3%) - в группе сравнения.

Биохимическое исследование метаболической активности кишечной микрофлоры по данным летучих жирных кислот проводилось методом газожидкостной хроматографии. Показатели аллергенспецифических IgE- и IgG4-антител в копрофильтратах у детей определялись с помощью неконкурентного иммуноферментного анализа с применением специальных тест-систем фирмы Allergopharma (Германия).

Обработку результатов проводили с использованием пакета прикладных программ STATISTICA фирмы StatSoftInc. (США) для персонального компьютера. Для анализа полученных результатов определяли средние значения признака (M), стандартные ошибки среднего (m). Достоверность различий оценивалась с помощью критерия Стьюдента (t) для независимых и связанных выборок при значениях вероятности p<0,05. Для сравнения показателей у больных до и после лечения также проводилось вычисление критерия Гехана–Вилкоксона, непараметрического аналога парного критерия Стьюдента (t-критерий для зависимых выборок), основанного на рангах. Различия между показателями расценивались как статистически значимые при p<0,05 или статистически высоко значимые - при p<0,01.

Результаты и обсуждение

При анализе показателей летучих жирных кислот у 200 детей на разных видах вскармливания были получены различия  в наблюдаемых подгруппах. У детей двух подгрупп (искусственное вскармливание) до приема смесей с пребиотиками показатели уксусной кислоты были снижены, что указывало на угнетение и снижение метаболической активности анаэробной микрофлоры кишечника. В группе сравнения (естественное вскармливание) показатель уксусной кислоты имел нормальное значение. На фоне приема смесей с пребиотиками в 1-й подгруппе отмечалось достоверное повышение концентрации уксусной кислоты (р≤0,05), во 2-й подгруппе наблюдалась тенденция к увеличению данного показателя.

Концентрация пропионовой кислоты до приема смесей с пребиотиками у детей 1-й подгруппы была ниже нормы, что указывало на угнетение основных продуцентов из-за дефицита в рационе питания пищевых волокон, преобладания в нем легко сбраживаемых простых углеводов и энергодефицита колоноцитов. Во 2-й подгруппе детей содержание пропионовой кислоты в кале было выше нормы, а в группе сравнения - соответствовало нормальным значениям. На фоне приема казеиндоминирующих смесей на основе цельного козьего молока с пребиотиками в 1-й подгруппе отмечалось незначительное увеличение показателя пропионовой кислоты, а во 2-й подгруппе (смеси на основе сывороточных белков коровьего молока) отмечалось достоверное повышение ее показателей (р≤0,05).

Показатели масляной кислоты до приема исследуемых смесей превышали норму в обеих подгруппах, а в группе сравнения соответствовали возрастным нормам. Изменение концентрации масляной кислоты в кале детей двух подгрупп свидетельствовало о снижении всасывательной функции слизистой оболочки толстой кишки и преобладание процессов брожения при колонизации условно-патогенной флорой. На фоне получения смесей с пребиотиками в обеих подгруппах значительных изменений этих показателей не наблюдалось.

Общий уровень метаболитов в кале был также ниже физиологической нормы в обеих подгруппах детей до приема смесей с пребиотиками, в группе сравнения - приближался к нормальным значениям. У детей обеих подгрупп на фоне приема смесей с пребиотиками отмечалось достоверное повышение общего уровня летучих жирных кислот (р≤0,03, р≤0,05 соответственно), что свидетельствовало о нормализации функциональной активности нормальной кишечной микрофлоры.

При сравнении содержания летучих жирных кислот на фоне приема казеиндоминирующих смесей на основе цельного козьего молока с пребиотиками (1-я подгруппа) показатели уксусной кислоты приближались к нормальным значениям, концентрация масляной кислоты, общий уровень метаболитов анаэробного индекса были также выше по сравнению с детьми, получавшими сывороточную смесь на основе сывороточных белковкоровьего молока с пребиотиками. Однако полученные различия не имели достоверности. Таким образом, полученные результаты у детей обеих подгрупп на фоне приема как казеиндоминирующих формул на основе цельного козьего молока, так и сывороточных смесей на основе белков коровьего молока свидетельствовали о повышении активности бифидо- и лактобактерий, хорошей утилизации уксусной и масляной кислот колоноцитами и другими видами микрофлоры, обеспечивавших потребность клетки в энергии, изменении родового состава микрофлоры, анаэробно-аэробных популяций микроорганизмов, приводивших к нормализации окислительно-восстановительного потенциала среды, что обеспечивало условия для активизации облигатной микрофлоры и восстановлению микробного протеолиза.

Таблица 1

Показатели летучих жирных кислот в копрофильтратах у здоровых детей (M+m)

Примечание: *различия до и на фоне диетотерапии достоверны, р≤0,03

**различия между подгруппами детей достоверны, р≤0,05

У наблюдаемых детей было проведено определение концентрации аллергенспецифических IgЕ и IgG- антител к белкам коровьего молока и козьему молоку в копрофильтратах на фоне грудного вскармливания (группа сравнения), а также до и на фоне приема смесей с пребиотиками (основная группа). Сравнительный анализ показал, что у 200 наблюдаемых детей частота обнаружения аллергенспецифических IgE- антител к белкам коровьего и козьего молока была 45,5% (91 ребенок) и 27% (54 ребенка) соответственно. Частота встречаемости аллергенспецифических IgG -антител к белкам коровьего и козьего молока у этих детей была ниже и составила 21,5% (43 ребенка) и 12% (24 ребенка) соответственно. Обращала на себя внимание одинаковая частота латентной сенсибилизации как у детей на искусственном вскармливании, так и у детей на естественном вскармливании, что, вероятно, было связано с повышенным употреблением молочных продуктов кормящими материями в период беременности и кормления грудью. Кроме того, у наблюдаемых детей на искусственном и естественном вскармливании частота латентной сенсибилизации к белку козьего молока была ниже в 1,7-1,8 раза по сравнению с частотой сенсибилизации к белкам коровьего молока (Табл.2).

У детей на искусственном вскармливании проводился сравнительный анализ влияния казеиндоминирующих формул на основе цельного козьего молока (1-я подгруппа) и формул на основе сывороточных белков коровьего молока (2-я подгруппа) на динамику показателей латентной сенсибилизации к молочным белкам. В 1-й подгруппе детей при сравнении частоты обнаружения  аллергенспецифических IgE антител до и на фоне приема смесей частота встречаемости IgE антител к белкам коровьего молока снизилась с 35,2% до 13,7%, к казеину – с 19,6% до 11,8%, к β-лактоглобулину – с 21,5% до 11,8%, к альфа-лактоглобулину – с 17,6% до 9,8%, к козьему молоку с 19,6% до 9,8%. На фоне приема этих смесей у детей преобладала низкая степень латентной сенсибилизации (+1) – у 71,4%; а умеренная степень (+2) – была у 28,6% человек.

Во 2-й подгруппе до и на фоне приема смесей на основе сывороточных белков коровьего молока частота обнаружения IgE антител к белкам коровьего молока снизилась с 59,1% до 20,4%, к казеину – с 28,5% до 16,3%, к β-лактоглобулину – с 26,5% до 14,2%, альфа-лактоглобулину – с 26,5% до 20,4%, к козьему молоку с 28,5% до 12,2%. При этом у детей отмечалась достаточно высокая частота умеренной степени латентной сенсибилизации (+2) – у 60%, а низкая степень сенсибилизации (+1) наблюдалась у 40% детей (Табл.2, 3).

Таблица 2 Частота встречаемости аллергенспецифических IgE и IgG4 антител к белкам коровьего молока и козьему молоку в копрофильтратах у здоровых детей до приема адаптированных смесей

Примечание:БКМ – белки коровьего молока; ЛГ - лактоглобулин; КМ – козье молоко

В обеих подгруппах детей до и на фоне приема смесей не было обнаружено значимого снижения частоты обнаружения аллергенспецифическихIgG4 антител к белкам коровьего молока, его фракциям и к козьему молоку. При этом в 1-й подгруппе детей, получавших смеси на основе цельного козьего молока, преобладала низкая степень сенсибилизации к белкам коровьего молока(+1) –у 2/3 младенцев, а во 2-й подгруппе преобладала умеренная степень сенсибилизации к белкам коровьего молока (+2) –также  у 2/3. Кроме того, у детей 1-й подгруппы на фоне приема смесей преобладала низкая степень латентной сенсибилизации (+1) к белку козьего молока, а у детей 2-й подгруппы сохранялась умеренная степень сенсибилизации (+2) к этому виду белка по данным IgG4антител (Табл.2,3).

Таблица 3 Частота встречаемости аллергенспецифических IgE и IgG4-антител к белкам коровьего и козьего молока в копрофильтратах у здоровых детей на фоне приема адаптированных смесей

Таким образом, у детей 1-й подгруппы на фоне приема смесей на основе цельного козьего молока отмечалась более выраженная динамика снижения частоты встречаемости аллергенспецифических IgE антител к белкам коровьего и козьего молока, при этом имело место преобладание низкой степени сенсибилизации (+1) к указанным видам белка. Несмотря на наличие аллергенспецифических IgE антител к белку козьего молока у 19,6% детей, получавших смеси на основе козьего молока (1-я подгруппа), аллергические проявления в виде высыпаний на коже отмечались только у одного (5,5%)ребенка. Полученные данные указывают на профилактические свойства казеиндоминирующих смесей на основе цельного козьего молока при наличии латентной сенсибилизации к белкам коровьего молока у детей.

У детей 2-й подгруппы, получавших смесь на основе сывороточных белков коровьего молока, динамика снижения частоты выявления аллергенспецифических IgE антител к белкам коровьего молока была менее выражена и сохранялась достаточно высокая частота умеренной степени сенсибилизации к этим белкам. При этом, у 4 (13,7%) младенцев из 29 детей 2-й подгруппы, имевших IgE антитела к белкам коровьего молока, отмечались аллергические проявления в виде высыпаний на коже легкой степени выраженности.

При анализе показателей аллергенспецифических IgE и IgG4 антител на фоне длительного (более 6 мес.) приема смесей в 1-й подгруппе детей было выявлено достоверное (P<0,05) снижение концентрации аллергенспецифических IgE антител к молочным белкам до нормативных значений, что указывало на профилактический эффект данных смесей при наличии сенсибилизации к коровьему и козьему молоку у детей раннего возраста (Табл. 4). Кроме того, у детей этой подгруппы было установлено снижение концентрации аллергенспецифических IgG4 антител к белкам коровьего и козьего молока до нормальных значений.

У детей 2-й подгруппы, имевших латентную сенсибилизацию к молочным белкам, на фоне длительного (более 6 мес.) приема смесей на основе сывороточных белков коровьего молока с пребиотиками нормализовались показатели аллергенспецифических IgE антител к молочным белкам. Тогда как анализ концентрации аллергенспецифических IgG4 антител к белкам коровьего и козьего молока показал наличие тенденции к снижению указанных антител в пределах +1 класса (Табл.4).

Таблица 4 Динамика показателей аллергенспецифических IgE и IgG4 антител у здоровых детей на фоне длительного приема смесей (М+m)

Примечание: различия до и на фоне диетотерапии достоверны, Р<0,05

При сравнительном анализе динамики частоты сенсибилизации к молочным белкам между подгруппами детей на искусственном вскармливании не было получено достоверных отличий, т.к. у всех наблюдаемых детей имело место снижение частоты сенсибилизации к годовалому возрасту, что указывало на формирование у них оральной толерантности к молочным белкам по мере их роста и развития.

Таким образом, при употреблении детьми смесей на основе разного источника белка с пребиотиками отмечалась положительная динамика ЛЖК, что свидетельствовало об улучшении функциональной активности кишечной микробиоты. Частота латентной сенсибилизации к молочным белкам у детей с возрастом снижалась, а у части младенцев исчезала. Достоверных различий указанных эффектов между детьми, получавшими казеиндоминурующие формулы на основе цельного козьего молока, и детьми, употреблявших сывороточные смеси на основе белков коровьего молока не было получено.

Список литературы

1.     Compare D., Nardone G. The role of gut microbiotain the pathogenesis and management of allergic diseases.Eur Rev Med PharmacolSCi 2013; 17:Suppl 2: 11-17.

2.     Wang F.S. Secretory immunoglobulin A in human milk and infants' feces at 1– 4 months after delivery. Chung Hua Fu Chan KoTsaChih 1995; 30: 10: 588– 590.

3.     Penders J., Thijs C., van der Brandt P.A. et al. Gut microbiota composition and development of atopic manifestations in infancy: the KOALA Birth Cohort Study.Gut2007; 56: 5:661–667.

4.     Blaiss M.S. Management of rhinitis and asthma in pregnancy. Ann Allergy Asthma Immunol 2003; 90: 16–22.

5.     Хавкин А.И. Микрофлора пищеварительного тракта. М.: Фонд социальной педиатрии, 2006; 416с.

6.     Бельмер С.В., Хавкин А.И. Руководство по детской гастроэнтерологии. М.: Медпрактика–М, 2004; 480с.

7.     Хаитов P.M., Игнатьева Г.А., Сидорович И.Г. Иммунология. Норма и патология. М.: Медицина, 2010; 752с.

8.     Fetherston C.M., Lai C.T., Hartmann P.E. Recurrent Blocked Duct (s) in a Mother with Immunoglobulin A Deficiency. Breastfeeding Medicine2008; 3: 4: 261–265.

9.     Meyer R., Shah N. The role of pre- and probiotics in infant nutrition. J Fam Health Care 2013; 2: 7: 25-29.

10. Shaker M. Nev insights in to the allergic march. CurrOpinPediatr2014; 26: 4: 516520.

11. Shi H.N., Walker A. Bacterial colonization and the development of intestinal defences. Can J Gastroenterol 2004; 18: 8: 493–500.

12. AstwoodJ.D., LeachJ.N., FuchsR.L. Stability of food allergens to digestion in vitro. Nat biotechnol 1996; 14: 10: 1269–1273.

13. Grant C., Rotherham B., Sharpe S. et al.randomised, double-blind comparison of goat milk and cow milk infant formula. J Paediatr Child Health 2005; 41: 564–568.

14. Шамова А. Г., Шамов Б. А., Денисова С. Н. Пищевая аллергия у детей (новые технологии профилактики и лечения). Методические рекомендации. Казань, 2005; 18с.

15. Денисова С.Н., Белицкая М.Ю., Сенцова Т.Б. Клиническая эффективность комплексной терапии у больных

раннего     возраста     с     аллергией     к      белкам     коровьего     молока     и     атопическим     дерматитом. Росвестнперинатолипедиатр 2013; 58: 1: 101-107.

16. Rust S.F., Thompson С., Minor P. Does breast-feeding protect children from asthma? Analysis of  NHANES Survey data. J Natl Med Assoc 2001; 93: 139–147.

17. Балаболкин И.И., Сенцова Т.Б., Денисова С.Н. и др. Эффективность естественного вскармливания при лечении атопического дерматита у детей: Методические рекомендации для врачей. М., 2005; 27.

18. Lara-Viloslada F., Olivares M., Jiménez J.et al. Goat milk is less immunogenic than cow milk in a murine model of allergy. J Pediatric GastroenterolNutr 2004; 39: 354-360.