АЛГОРИТМ ВЫБОРА ОПТИМАЛЬНОГО СПОСОБА ПОЛУЧЕНИЯ БАКТЕРИАЛЬНЫХ АНТИГЕНОВ

На сегодняшний день антигены микроорганизмов уже доказали свою значимость в профилактике и диагностике различных инфекционных заболеваний. На основе бактериальных антигенов разрабатываются эталонные антигенные препараты и тест-системы для иммунодиагностики, создаются вакцины для иммунопрофилактики. Антигены используют для иммунизации животных с целью получения поликлональных и моноклональных антител, а также для стандартизации иммуноглобулиновых диагностических тест-систем.

Существует большое  разнообразие методов  выделения  бактериальных антигенов и их модификаций. Выбор того или иного метода обусловлен прежде всего целями и задачами, поставленными перед исследователем. Для выбора наиболее эффективного метода необходимо определить, какую природу имеет целевой антиген (белок, липополисахарид и др.), где относительно клетки он локализуется (внутриклеточный или внеклеточный), в каком виде – в чистом виде или же в комплексе с другими антигенами его необходимо получить.

Антигенная структура микроорганизмов очень разнообразна. В бактериальной клетке выделают следующие антигены. Жгутиковые H-антигены локализуются в жгутиках бактерий и представляют собой эпитопы белка флагеллина. H-антигены чувствительны к высоким температурам, но устойчивы к фенолу. Соматический О-антиген связан с клеточной стенкой бактерий. Он имеет липополисахарадную или липополисахаридно-белковую природу. Соматический антиген термостабилен и выдерживает длительное кипячение, но чувствителен к альдегидам и спиртам. Капсульные К-антигены (поверхностные антигены) встречаются у капсулообразующих бактерий и имеют белковую или гетерополисахаридную природу. Среди К-антигенов встречаются как термостабильные, так и термолабильные антигены [6]. Также антигенными свойствами обладают различные метаболиты бактерий: ферменты, токсины и др.

Проанализировав  антигенную  структуру  микроорганизма  и  определив  цель  эксперимента необходимо подобрать наиболее эффективный метод для решения конкретной экспериментальной задачи.

Для выделения липополисахаридов (ЛПС)  можно применять  экстракцию антигенов трихлоруксусной кислотой, водно-эфирной и водно-бутанольной смесью [4].

Часто в целях выделения ЛПС используют фенол.

Известен метод выделения ЛПС с использованием экстракции смесью фенол-хлороформ- петролейный эфир [14].

Е.Ю. Маркова и соавт. описали применение водно-фенольной экстракции и очистки ЛПС от примесей путем обработки водной фазы детергентом Тритоном Х-114. После чего ЛПС выделяли осаждением холодным ацетоном [9].

Наиболее распространенным методом  выделения  ЛПС является водно-фенольный метод по  O. Westphal [3, 7, 15].

Однако вышеописанные методы имеют ряд недостатков, обусловленных применением агрессивного химического вещества – фенола, способного негативно влияют на исходную структуру биополимера, его биологическую активность, а также здоровье человека. Длительность  и многоэтапность  процесса, недостаточно высокая степень очистки целевого ЛПС и значительные его потери на этапе ультрацентрифугирования также являются слабыми сторонами рассмотренных методов.

В современных более щадящих методах отказываются от применения фенола и упрощают сам процесс получения препарата ЛПС. Экстракцию ЛПС из наружной мембраны проводят различными буферными растворами, основным компонентом которых является ЭДТА. Очистку ЛПС от белковых примесей осуществляют путем обработки препарата коммерческой протеиназой К [11] или ферментным комплексом протеовибрином [10].

Для выделения соматического О-антигена в большинстве случаев применяют его свойство термостабильности. Бактериальные культуры подвергают воздействию высоких температур, например, прогревают при 100 оС. При этом чувствительные к высоким температурам антигены разрушаются, а термостабильный О-антиген остается неповрежденным [3, 13].

Для получения антигенов белковой природы используют различные методы дезинтеграции бактериальных клеток. В зависимости от экспериментальных задач полученный дезинтеграт может быть использован как комплексный антиген или же как источник получения отдельных видов антигенов.

Известны различные методы дезинтеграции бактериальных клеток: гомогенизация с диметилсульфоксидом (ДМСО) [8], криогенный метод [2, 5, 13], обработка ультразвуком [2, 5, 7].

Метод обработки ультразвуком, по данным ряда статей, является наиболее эффективным. Использование данного метода требует экспериментального подбора оптимального режима воздействия ультразвука на конкретный микроорганизм. В ходе эксперимента отрабатывают такие параметры как время действия ультразвука, его мощность и амплитуду зонда.

Для выделения целевых белков из дезинтеграта, разделения белков на фракции или выделения внеклеточных белков из культуральной жидкости применяют различные методы осаждения: высаливание (чаще сульфатом аммония), осаждение органическими растворителями при условии их кратковременного воздействия, осаждение в изоэлектрической точке и другие [12].

В настоящее время для разделения смеси белков, их очистки и анализа широко используются хроматографические методы, основанные на распределении анализируемых веществ между неподвижной (жидкость или твердое вещество) и подвижной (жидкость или газ) фазами. В зависимости от принципа действия различают гель-хроматографию, адсорбционную хроматографию, распределительную хроматографию, ионообменную хроматографию, аффинную хроматографию [1].

Кроме вышеперечисленных методов, а также в комплексе с ними, для разделения суспензии на фракции активно применяют электрофорез и центрифугирование, а на заключительных стадиях очистки – диализ.

Таким образом, для выбора оптимального способа получения бактериальных антигенов необходимо четко сформулировать цель и задачи эксперимента, проанализировать природу антигена и, используя наиболее эффективный метод для конкретной экспериментальной задачи, подобрать оптимальные условия для выделения целевого антигена.

Список литературы

1. Биохимия: Учебник / под ред. Е.С. Северина. 2-е изд., испр. М.: ГЭОТАР-МЕД, 2004. 784 с.: ил.

2. Васильев Д.А., Хлынов Д.Н. Получение различных типов антигенов Listeria monocytogenes для иммуноферментного анализа // Вестник ульяновской государственной сельскохозяйственной академии. 2011. № 4. С. 43–48.

3. Вахрамеева М.С. Анализ антигенной структуры Helicobacter pylori и разработка тест-систем для неинвазивной диагностики хеликобактериоза: автореф. дис. на соиск. учен. степ. канд. мед. наук: 03.00.07 / Вахрамеева Марина Сергеевна. М., 2004. 32 с.

4.    Захарова И.Я., Косенко Л.В. Методы изучения микробных полисахаридов. Киев: Наукова думка, 1982. 192 с.

5. Курьянова Н.Х. Разработка биотехнологических параметров по получению протективного инактивированного антигена Оrnithobacterium rhinotracheale // Наука в современных условиях: от идеи до внедрения. 2013. № 1. С. 24–29.

6. Медицинская микробиология, вирусология и иммунология. В 2-х т. Том 1: учебник / под ред. В.В. Зверева, М.Н. Бойченко. М.: ГЭОТАР-Медиа, 2010. 448 с.

7. Получение и изучение антигенных свойств микобактериальных антигенов / А.А. Ахаева [и др.] // Биотехнология. Теория и практика. 2008. № 2. С. 47–51.

8. Способ получения антигена с молекулярной массой 45 кДа из Mycobacterium tuberculosis / Элдер Алфредо [и др.] // Фундаментальные исследования. 2013. № 1. С. 18–22.

9. Способ получения бактериальных липополисахаридов: пат. 2051969 РФ: МПК6 C12P19/04 / Марков Е.Ю., Николаев В.Б.; патентообладатель: Иркутский научно-исследовательский противочумный институт Сибири и Дальнего Востока. № 5057385/13; заявл. 31.07.92; опубл. 10.01.96.

10.   Способ получения липополисахарида возбудителя чумы: пат. 2483112 РФ: МПК C12P19/04 (2006.01), A61K39/02 (2006.01), A61K39/39 (2006.01) / Полунина Т.А. [и др.]; патентообладатель РосНИПЧИ «Микроб» Роспотребнадзора. № 2012113021/10; заявл. 03.04.12; опубл. 27.05.13, Бюл. № 15.

11.   Способ получения липополисахаридов: пат. 2237719 РФ: МПК7 C12P19/04, A61K39/02, A61K39/39, G01N33/53 / Бурыгин Г.Л., Матора Л.Ю., Щеголев С.Ю.; патентообладатель Институт биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН. № 2002132049/13; заявл. 28.11.02; опубл. 10.10.04, Бюл. № 28.

12.   Справочник биохимика / Р. Досон [и др.]; пер. с англ. М.: Мир, 1991. 544 с.

13.   Сугирбаева Г.Д., Матраимов М.Б., Кошеметов Ж.К. Получение специфического антигена к возбудителю Сlostridium perfringens // Наука, новые технологии и инновации Кыргызстана. 2015. № 4. С. 132–133.

14.   Galanos C., Luderitz O., Westphal O.A. New method for the extraction of R lipopolysaccharide // Eur. J. Biochem. 1969. Vol. 9. P. 245–249.

15.   Westphal О., Luderitz О., Bister F. Über die Extraktion von Bakterien mit Phenol/Wasser // Zeitschrift für Naturforschung B. 1952. Vol. 7, no. 3. Р. 148–155.