14 апреля 2017г.
STABILITY OF SPIRULINA SUBSALSA PHYCOCYANIN UNDER DIFFERENT TEMPERATURE STORAGE CONDITIONS
Petrukhina DI, Lykov IN
Kaluga State University named after KE. Tsiolkovsky, Kaluga
Фикоцианин цианобактерий играет важную роль в биотехнологических отраслях (Spolaore etc, 2006). Нами установлена возможность низкотемпературного хранения цианобактерии рода Spirulina (Петрухина, Лыков, 2015; Petrukhina, Lykov, 2016), после которого ее биомасса может быть использована для получения фикоцианина. Тем не менее, фикоцианин очень чувствителен к действию протеаз, света, кислорода, влаги и температуры, то есть легко разлагаются в естественном состоянии (Kannaujiya1, Rajeshwar, 2015). Некоторые консерванты, такие как дитиотреитол (ДТТ), азид натрия, лимонная кислота, хлорид натрия, сахароза, бензойная кислота, хлорид кальция и аскорбиновая кислота поддерживают термостабильность фикоцианина (Chaiklahan etc. 2012; Kannaujiya1, Rajeshwar, 2015).
Целью нашего исследования было определить стабильность фикоцианина, полученного из
цианобактерии Spirulina subsalsa при различных температурах.
Методы исследования
Фикоцианин получали из цианобактерии Spirulina subsalsa штамм PCC 9445 по методу Liotenberg, Campbell и др. (1996). Цианобактерию Spirulina subsalsa PCC 9445 хранили при температуре -80°С одну неделю в присутствии диметилсульфоксида в концентрации 10,0%, а после оттаивания выращивали в автоклавированных конических стеклянных колбах Эрленмейера с широким горлышком по ранее опубликованной методике (Петрухина, Лыков, 2015).
Фикоцианин хранили в течение 57 дней при температурах -18, 4, 25 и 37°С. Проводили сравнение устойчивости двух форм хранения фикоцианина (в виде порошка и раствора). Порошок получали методом лиофилизации. Для получения раствора фикоцианин после лиофилизации растворяли в фосфатно-калиевом буферном растворе при рН 7,0. Начальную концентрацию фикоцианина определяли спектрометрически. Затем к раствору в качестве консерванта добавляли смесь аскорбиновой и розмариновой кислот в концентрации 0,3%.
Для оценки стабильности фикоцианина во время хранения сравнивали значения начальной и конечной концентрации. Измерения проводили на UV/VIS-спектрофотометре (Beckman DU640, США) при длине волны (Е) 615 и 652 нм. Концентрацию фикоцианина (Х) рассчитывали по формуле в мг/мл:
X = (E615 - 4,417 × E652) / 5,34
Скорость разрушения фикоцианина (k, день-1) за период хранения рассчитывали по следующей формуле:
k = (-ln (X / X0)) / ∆t
где X - концентрация фикоцианина после периода хранения, мг/мл; X0 - начальная концентрация фикоцианина, мг/мл; ∆t –период хранения, день.
Результаты исследований
После 57 дней хранения фикоцианина в фосфатно-калиевом буфере (рис. 1) его концентрация не снижалась по сравнению с начальной концентрацией при температурах хранения в -18 и 4°С. Снижение концентрации начало проявляться при температурах хранения 25°C и 37°C.
Скорость разложения фикоцианина в фосфатно-калиевом буфере после 57 дней инкубации при температурах в 25 и 37°С увеличилась соответственно до 0,0059 и 0,0335 день-1 от начального значения. Однако при температурах хранения в 4 и -18°С скорость разложения фикоцианина в фосфатно-калиевом буфере не изменилась (рис. 2).
После 57
дней хранения фикоцианин в виде
порошка
его
концентрация была близка к первоначальной при температурах хранения в -18 и 4°С (рис. 3).
Порошок фикоцианина был значительно более стабильным, по сравнению с раствором фикоцианина в фосфатно-калиевом буфере (рис. 4).
После 57 дней хранения при 25°C концентрация фикоцианина снизилась до 0,1593 мг/мл, скорость разложения увеличилась до 0,0012 день-1 от начального значения. При повышении температуры хранения до 37°С концентрация фикоцианина и скорость его разложения не изменились по сравнению с результатами, полученными при температуре хранения в 25°С. Концентрация фикоцианина после 57 дней хранения при 37°С составила 0,1599 мг/мл, а скорость разложения 0,0011 день-1.
Время, за которое начальная концентрация фикоцианина в фосфатно-калиевом буфере при температуре хранения в 25 и 37°С снизилась вдвое, составило 117 и 20 дней, соответственно (рис. 5).
В
аналогичных условиях время хранения фикоцианина в виде порошка увеличилось до 588 дней и 623 дней (рис. 6).
Имеются данные
о
том,
что фикоцианин Spirulina sp. разлагается более чем
на 80%
при температурах в интервале от 26 до 74°C (Chaiklahan etc, 2012). В нашем исследовании мы наблюдаем более низкую скорость разложения и длительное время сохранения фикоцианина в виде порошка. Таким образом фикоцианин из Spirulina subsalsa хранящийся в виде порошка по нашей методике при 25 и 37°С более стабилен, чем фикоцианин, полученный Chaiklahan и др. (2012).
Наши результаты также подтверждают сведения о разложении фикоцианина в фосфатно-калиевом буфере при температуре 37°C. Для уменьшения негативного влияния этого диапазона температуры мы добавили в раствор фикоцианина в фосфатно-калиевом буфере консервант в виде смеси аскорбиновой и розмариновой кислот, в концентрации 0,3%. Это позволило повысить стабильность фикоцианина и снизить скорость его разложения при температуре в диапазоне 25-37°С.
Список литературы
1.
Петрухина Д.И., Лыков И.Н. Исследование эффективности сохранения цианобактерий Arthrospira platensis и Spirulina subsalsa после криоконсервации диметилсульфоксидом при -80 °С. Вестник биотехнологии и физико-химической биологии имени Ю.А. Овчинникова. 2015, Т. 11, № 4, с. 26-31.
2.
Петрухина Д.И., Лыков И.Н. Исследование эффективности сохранения цианобактерии Spirulina subsalsa после криоконсервации при -80°С в присутствии глюкозы. Известия вузов. Прикладная химия и биотехнология. 2016, Т. 6, № 4, с. 68-73.
3.
Chaiklahan R, Chirasuwan N, Loha V, Tia S, Bunnag B. Separation and purification of phycocyanin from Spirulina sp. using a membrane process. Bioresource Technology. 2011, Volume 102, Issue 14, p. 7159-7164. DOI: 10.1016/j.biortech.2011.04.067.
4.
Kannaujiya VK, Sinha RP. Thermokinetic stability of phycocyanin and phycoerythrin in food-grade preservatives. Journal of Applied Phycology. 2016, Volume 28, Issue 2, p. 1063–1070. DOI: 10.1007/s10811-015-0638-x.
5.
Liotenberg S, Campbell D, Rippka R, Houmard J, Tandeau de Marsac N. Effect of the nitrogen source on phycobiliprotein synthesis and cell reserves in a chromatically adapting filamentous cyanobacterium. Microbiologia. 1996, Volume 142, p. 611-622.
6.
Petrukhina DI, Lykov IN. Freezing and storage of the cyanobacterium Spirulina subsalsa at low temperature
(-80°C). Science, Technology and
Higher Education: materials of the
XI International research and practice conference, Westwood, October 19th-20th, 2016 / publishing office Accent Graphics communications – Westwood – Canada, 2016. – p. 128-131.
7.
Spolaore P, Joannis-Cassan C, Duranb E, Isamberta A. Commercial applications of microalgae. Journal of Bioscience and Bioengineering. 2006, Volume 101, Issue 2, p. 87-96.
