14 июля 2017г.
Введение
COrDIS Cattle – набор реагентов для молекулярно-генетической характеристики крупного рогатого скота с целью анализа родства и ДНК-индивидуализации животных на основе мультиплексного ПЦР- анализа 14-ти локусов, содержащих короткие тандемные повторы (STR), известные также как микросателлитные локусы [1].
Из 14-ти анализируемых STR-локусов 11 составляют стандартную панель маркеров, рекомендованную Международным Обществом Генетики Животных (International Society of Animal Genetics - ISAG): ETH3, INRA023, TGLA227, TGLA126, TGLA122, SPS115, ETH225, TGLA53, BM2113, BM1824, ETH10. Кроме того, в набор входят три дополнительных высокополиморфных микросателлитных локуса:
CSSM66, ILSTS006 и CSRM60. Все эти локусы представляют собой тандемные динуклеотидные повторы.
Основная часть
Праймеры для ПЦР подобраны с учетом проведения амплификации всех 14-ти локусов в одной пробирке. Размер всех амплифицируемых ПЦР продуктов < 320 пар нуклеотидов (с учетом всех известных аллелей). Анализ результатов ПЦР проводится методом капиллярного электрофореза с использованием автоматических генетических анализаторов с лазериндуцированной флуоресцентной детекцией. В наборе COrDIS Cattle используется пять флуоресцентных красителей, характеризующихся разными длинами волн эмиссии для возможности одновременной детекции в разных каналах флуоресценции. Праймеры мечены четырьмя флуоресцентными красителями детектируемыми в каналах Blue, Green, Yellow, Red. Стандарт длины S450 мечен пятым, флуоресцентным красителем и детектируется в отдельном канале Orange одновременно с продуктами ПЦР.
Для получения полного STR-профиля образца достаточно 0,2 нанограмм недеградиронной ДНК. Оптимальное количество – 0,5 нанограмм.
Реакционная смесь в наборе аликвотирована в реакционных стрипованных пробирках 0,2 мл и поставляется в лиофилизированном виде, благодаря чему реакционные смеси могут храниться при комнатной температуре не менее 18 месяцев без потери чувствительности. Компоненты реакции активируются добавлением определенного объема раствора активатора в каждую пробирку. Общий объем реакции 20 мкл. Максимальный объем вносимого в реакцию раствора ДНК может составлять 16 мкл. Благодаря высокой устойчивости реакционной смеси к действию ингибиторов, большой объем препарата ДНК не препятствует успешной амплификации.
Набор валидирован для проведения ПРЦ в амплификаторах: GeneAmp® 9700, GeneAmp® 2720, MJ Research PTC-100 , BioRAD MyCycler, Biometra TPersonal, Eppendorf Mastercycler. Анализ ПЦР-продуктов может проводится с использованием генетических анализаторов ABI PRISM® 310/3100/3100- Avant/3130/3130XL/3500/3500XL (Applied Biosystems).
Таблица 1. Описание микросателлитных маркеров COrDIS Cattle
|
Локус
|
Хромосомная локализация
|
Тип повтора
|
Структура единицы повтора
|
|
BM1824
|
D1S34
|
простой
|
(GT)n
|
|
BM2113
|
D2S26
|
простой
|
(CA)n
|
|
CSRM60
|
D10S5
|
простой
|
(AC)n
|
|
CSSM66
|
D14S31
|
простой
|
(AC)n
|
|
ETH3
|
D19S2
|
сложной
|
(GT)nAC(GT)6
|
|
ETH10
|
D5S3
|
простой
|
(AC)n
|
|
ETH225
|
D9S2
|
сложной
|
(TG)4CG(TG)(CA)n
|
|
ILSTS006
|
D7S8
|
простой
|
(GT)n
|
|
SPS115
|
D15
|
сложная
|
(CA)nTA(CA)6
|
|
INRA023
|
D3S10
|
простой
|
(AC)n
|
|
TGLA53
|
D16S3
|
сложной
|
(TG)6CG(TG)4(TA)n
|
|
TGLA122
|
D21S6
|
сложной
|
(AC)n(AT)n
|
|
TGLA126
|
D20S1
|
простой
|
(TG)n
|
|
TGLA227
|
D18S1
|
простой
|
(TG)n
|
1. Информация для заказа набора COrDIS Cattle и его компонентов
Набор COrDIS Cattle может поставляться в пробирках, объединенных по 8 штук в стрипы с отдельно прикрепленными крышками, либо в 96-луночных планшетах:.
Стрипы 8 x 0.2 мкл, пробирки с отдельноприкрепленными крышками
Название Реакций в наборе Каталожный номер
COrDIS Cattle 12 x 8 пробирок (96 реакций) КРС-108S
Планшеты 96 x 0,2 мл (перфорированные планшеты, могут быть разделены на 4 части по 24 реакции)
Название Реакций в наборе Каталожный номер
COrDIS Cattle 1 x 96 пробирок (96 реакций) КРС -196P
2. Компоненты набора и состав
1. Стрипы с реакционными смесями 8 x 0.2 мл 12 стрипов
2. Раствор активатора (голубая крышка) 600 мкл
3. Деионизованная вода (белая крышка) 2.0 мл
4. Контрольная ДНК КРС1, 20 нг 1 пробирка (40 реакций)
5. Стандарт длины S450, 1 пробирка (120 нанесений)
Стрипы с реакционными смесями представляют собой реакционные пробирки объемом 0.2 мл, объединенные в стрипы по 8 шт и предназначены для проведения в них полимеразной цепной реакции. На дне пробирок содержатся все лиофилизированные компоненты полимеразной цепной реакции включая Taq- полимеразу, смесь дНТФ, реакционный буфер, праймерную смесь. Благодаря флуоресцентно-меченным праймерам лиофилизированная сухая стекловидная реакционная смесь на дне пробирок имеет розовый цвет. Наборы могут также комплектоваться реакционными смесями, аликвотированными в реакционных 96- луночных планшетах.
Раствор активатора используется для разведения лиофилизированной реакционной смеси. Содержит буферный раствор и ионы магния Mg2+ в качестве активатора полимеразной цепной реакции.
Деионизированная вода предназначена для разведения компонентов набора и доведения реакций до рабочего объема.
Контрольная ДНК КРС1 представляет собой 20 нг высокомолекулярной лиофилизированной геномной ДНК коровы с известным генотипом по всем исследуемым локусам. Предназначена для контроля этапов амплификации, электрофореза и анализа данных. Поставляется в лиофилизированном виде. Перед использованием требует разведения водой.
Стандарт длины S450 представляет собой лиофилизированную смесь флуоресцентно-меченных фрагментов ДНК разной длины, меченых спектральным аналогом LIZ, детектируемым в канале Orange. Стандарт длины S450 содержит 24 фрагмента ДНК разной длины (н.п.): 60, 70, 80, 90, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 220, 230, 240, 260, 280, 300, 320, 340, 360, 380, 400, 420, 440 и 450. Стандарт S45 0 используется на
этапе капиллярного электрофореза, вносится в каждый капилляр одновременно с исследуемым образцом и служит опорным внутренним стандартом для построения кривой подвижности амплифицированных фрагментов исследуемого образца. Благодаря высокой плотности фрагментов стандарта S450 обеспечивается высокая точность и воспроизводимость определения длины амплифицированных фрагментов исследуемого образца. Перед использованием требует добавления воды.
3. Условия хранения
Все компоненты за исключением раствора активатора и деионизированной воды, поставляются в сухом виде. В связи с этим при транспортировке не требуется соблюдение специального температурного режима. Флуоресцентно меченные праймеры и размерный стандарт S450 чувствительны к воздействию света и должны храниться в темном месте. Пользователи могут хранить наборы при комнатной температуре в течение нескольких месяцев без потери чувствительности.
Контрольная ДНК, аллельный лэддер и размерный стандарт после разведения лиофилизированных компонентов водой, должны храниться при 2 - 8°C в течение месяца. Для более длительного хранения рекомендуется заморозка при -20°C.
4. Основные характеристики набора
Количество одновременно анализируемых маркеров – 14;
Список одновременно анализируемых локусов: ETH3, INRA023, TGLA227, TGLA126, TGLA122, SPS115, ETH225, TGLA53, BM2113, BM1824, ETH10, CSSM66, ILSTS006 и CSRM60;
Количество флуоресцентных меток, используемых в наборе – 5;
Оптимальное количество вносимой ДНК: 0,2 – 2 нг Предел чувствительности: < 100 пг;
Дискриминирующий потенциал набора: менее 1 из 1010
На рис.1 приведены полученные результаты с использованием данного набора
Выводы
Генотипирование крупного рогатого скота полученные с использованием набора COrDIS Cattle показывают хорошие результаты. При этом стоимость данного набора 4 раза дешевле аналогичного набора Applied Biosystems.
Список литературы
1. Орехов В.А. Отечественные наборы для идентификации личности. Материалы Международной конференции «Достижение ДНК технологии в России». Москва, 12-16 октября, 2012 г. с.27-33.
