ОПРЕДЕЛЕНИЕ МЕБЕНДАЗОЛА В КРОВИ

Мебендазол (5-бензоил-2-метоксикарбониламино-бензимидазол) – лекарственный препарат глистогонного действия, производное бензимидазола [2, 3].

По физическим свойствам это аморфный порошок белого цвета с желтым оттенком практически нерастворимый в воде, щелочи, кислотах и спиртах, имеет ограниченную растворимость в простых эфирах и метиленхлориде, легко растворим в муравьиной кислоте, диметилформамиде и диметилсульфоксиде [4, 5].

Мебендазол обладает средней токсичностью, за счет плохой всасываемости из желудочно-кишечного тракта. ЛД50 при введении в желудок крыс составляет 1280 мг/кг.

В настоящее время препарат недостаточно изучен с химико-токсикологической точки зрения, однако токсические  воздействия  на  организм  теплокровных  при  передозировке  позволяют  считать  его потенциальным объектом исследования.

Цель исследования – изучение особенностей определения мебендазола в крови, его идентификацию и количественное определение.

Материалы и методы исследования

Объектами исследования явились мебендазол и таблетки мебендазола 0,1 г, соответствующие требованиям НД 42-6939-05.

Проводилось    исследование    модельных    экспериментальных    смесей     мебендазола    с    кровью выдержаного при комнатной температуре 1,5 часа.

Был осуществлен поиск оптимальных условий изолирования аналита из крови ацетоном.

Очистка  извлечения  осуществлялась  нормальнофазовой  колоночной  хроматографией  низкого давления., с последующей идентификацией хроматографией в тонких слоях сорбента.

Количественное определение и подлинность осуществляли УФ-спектрофотометрией, используя прибор СФ-2000.

Результаты и их обсуждение

Оптимальное извлечение мебендазола из крови осуществляется двукратным настаиванием с ацетоном в количестве, превышающем массу биоматериала в два раза, по 45 минут каждое.

Очистку аналита от биологической матрицы и сопутствующих эндогенных соединений осуществляли хроматографией низкого давления на колонке с диаметром 11 мм, заполненной 10 г нормальнофазового сорбента силикагель L 40/100. Элюирование осуществляли системой ацетон-дихлорметан (8:2). Фракции собирались по 2 мл, выход мебендазола наблюдался в 8-12 фракции.

Электромагнитное поглощение мебендазола определяли в среде диметилсульфоксида. В диапазоне длин волн 245-380 нм имеет две точки экстремума при 265 нм и 320 нм, далее для данных точек были определены параметры молярного коэффициента поглощения 27401 и 22279 соответсвенно.

Была изучена линейная зависимость поглощения различных концентраций раствора мебендазола в диметилсульфоксиде в интервале 2,5-80 мкг/мл в области 320 нм. Полученное уравнение градуировочного графика для определения количественного содержания аналита в фотометрируемом растворе имело вид: А = k∙С + b = 0,007997871хC+0,003390104, где А – оптическая плотность; С – концентрация мебендазола в измеряемом растворе, мкг/мл. Коэффициент корреляции данного графика составлял 0,9996.

Изолирование. 25 г экспериментальной смеси определяемого вещества с кровью настаивали с ацетоном дважды по 50 г 45 мин каждый. Извлечения фильтровали через бумажный фильтр, который затем промывали 20 г ацетона, после чего их объединяли. Дальнейшую очистку проводили через стеклянный фильтр диаметром 4 см со слоем безводного натрия сульфата 1 – 1,5 см, натрия сульфат так же промывали 20 г ацетона. Полученный фильтрат испаряли досуха при нормальных условиях.

Очистка. Полученное высушенное извлечение растворяли в смеси ацетон-дихлорметан (8:2) и вводили в колонку, заполненной нормальнофазовым сорбентом силикагель L 40/100, размером 490*10 мм. Хроматографировали мебендазол смесью ацетон-дихлорметан (8:2). Фракции элюэнта собирали по 2 мл с момента ввода смеси в систему, фракции с 8 по 12, предположительно содержащие мебендазол, объединяли и упаривали досуха при комнатной температуре, полученный остаток сухого извлечения мебендазола из крови растворили в 5 мл метиленхлорида (исходный раствор). В три фарфоровые выпарительные чашки было внесено 0,2 мл, 2 мл и 1 мл «исходного раствора» соответственно. Извлечения во всех чашках были так же упарены досуха при нормальных условиях в токе воздуха.

Идентификация. Остаток № 1 растворяли в 0,2 мл диметилсулфоксида и количественно наносили в виде на хроматографическую пластину «Сорбфил» ПТСХ-АФ-А-УФ.

Хроматографировали в присутствии вещества-свидетеля, используя смесь Изопропанол-Гексан (8:2) в качестве подвижной фазы. Полученные хроматограммы детектировали в УФ-свете и идентифицировали анализируемое вещество по совпадающей с веществом-свидетеля величине Rf, (0,44±0,05). Далее участок, предполагаемо содержащий анализируемое вещество вырезали и полученный оьрезок помещали в пробирку. Аналит элюировали 5 мл диметилсульфоксида в течение 15 мин из сорбента, при периодическом помешивании, и определяли его поглощаемость электромагнитного излучения в диапазоне длин волн 245- 380 нм. Анализируемое соединение определяли по уникальной форме спектральной кривой и характерному положению точек экстремума.

Количественное определение. Используя уравнение градуировочного графика, было посчитано количественное содержание мебендазола в полученном извлечении с учетом навески, по величине интенсивности поглощения раствора при 320 нм. Результаты определения количественного содержания аналита в крови методом УФ-спектрофотометрии представленны в таблице.

Таблица Результаты определения количественного содержания мебендазола в крови на основе изолирования ацетоном (n=5, P=0,95)

Исходя из данных полученных в ходе эксперимента, при содержании мебендазола в 25 г крови в количестве 2,5-50,0 мг с используя разработанную нами методику возможно обнаружить 85,85-87,69 % аналита. Определяемый минимум разработанной нами методики 0,25 мг.

Выводы

1. Для извлечения мебендазола из крови был выбран ацетон, как оптимальный изолирующий агент. Установлены оптимальные условия для его изолирования.

2.    Для очистки определяемого соединения от соэкстрактивных веществ биологической матрицы применена колоночная хроматография низкого давления в нормальнофазовом сорбенте силикагель L 40/100 мкм.

3. Рассмотрены варианты идентификации и определении количественного содержания мебендазола в извлечениях из крови методами тонкослойной хроматографии и УФ-спектрофотометрии..

Список литературы

1.   Баранов Ю.Н., Шорманов В.К., Коваленко Е. А. Цацуа Е. П.. Определение банкола в крови // Перспективы развития современной медицины: сборник научных трудов по итогам международной научно-практической конференции (Воронеж, 11 декабря 2016 г.). – Воронеж: Инновационный центр развития образования и науки; Воронеж, 2016. – С. 204-211.

2.   Мебендазол. Субстанция // Европейская Фармакопея на русском языке. Восьмое издание. Т. 2. -Москва: «Ремедиум», 2015. - С. 2696-2697.

3.   Шорманов В.К., Пугачёва О.И., Асташкина А.П., Цацуа Е.П. Особенности распределения 2,6-ди- трет-бутил-4-метилгидрокси-бензола в организме теплокровных животных. Судебно-медицинская экспертиза. 2016;59(1):29-34

4.     Шорманов В.К., Галушкин С.Г., Терских А.П. Распределение карбосульфана в организме теплокровных животных // Судебно-медицинская экспертиза. –  2015. – Т. 58, № 5. – С. 23-29.

5.            Шорманов В.К., Галушкин С.Г., Терских А.П. Изолирование диметоата из растительных биологических объектов // Проблемы медицины в современных условиях: сборник научных трудов по итогам международной научно-практической конференции (Казань, 10 июня 2014 г.). – Казань: Инновационный центр развития образования и науки; ГБОУ ВПО Казанский государственный медицинский университет, 2014. – С. 351-353.