07 января 2016г.
В последние десятилетия у пациентов с хроническими бронхолегочными заболеваниями отмечено увеличение удельного веса обострений, вызванных микробными ассоциациями. Микроорганизмы-ассоцианты взаимно влияют на основные биологические свойства друг друга. Например, стафилококки активируют факторы патогенности дрожжеподобных грибов и этим повышают их устойчивость к антимикотическим препаратам. Грибы рода Candida усиливают размножение Pseudomonas aeruginosa [3]. В этих условиях своевременное выявление и определение состава микробных ассоциаций при обострениях хронических инфекционно- воспалительных заболеваний легких (ХИВЗЛ) очень важно.
Цель - определить роль и состав микробных ассоциаций, участвующих в этиологии обострений ХИВЗЛ у детей разными лабораторными методами.
Материалы и методы
45 детей в возрасте от года до 17 лет, проходившее лечение в ГБУЗ СО «ОДКБ №1» г. Екатеринбурга, с обострением бронхоэктатической болезни и хронического бронхита обследованы комплексом методов: культуральным, полимеразной цепной реакцией (ПЦР), непрямой иммунофлюоресценции, газожидкостной хроматографии (ГЖХ), иммуноферментным анализом (ИФА). Контрольная группа - дети без инфекционной бронхолегочной патологии (n=45). Материалом для культурального исследования у детей с обострением ХИВЗЛ служили образцы бронхоальвеолярного лаважа (БАЛ, n=25), мокроты (n=10), плеврального выпота (n=10). У детей без инфекционной бронхолегочной патологии - БАЛ (n=10) и отделяемое со слизистой зева (n=35). Методика посева и набор питательных сред определялись видом исследуемого клинического материала. Видовую идентификацию проводили классическими бактериологическими методами и с использованием тест- систем для полуавтоматического (ATB Expression, bioMerieux, Франция) и автоматического (MicroScan WalkAway 96, Siemens, Германия) анализаторов. IgM и IgG определяли методом непрямой иммунофлюоресценции к: Parainfluenza, серотипы 1, 2, 3; Influenza A, B; Respiratory Syncytial Virus; Adenovirus; Chlamidophyla pneumoniae; Mycoplasma pneumoniae; Coxiella burnetii; Legionella pneumophila, серогруппа 1 (Vircell microbiologists, pneumoslide, Испания) в сыворотке крови 45 детей с обострением ХИВЗЛ. Методом ИФА в парных сыворотках крови 45 детей с обострением ХИВЗЛ и без инфекционной бронхолегочной патологии определяли уровень IgG к полирибозилрибитолфосфату Haemophilus influenzae типа b и к бактериальным антигенам бескапсульного штамма H. influenzae; Streptococcus pneumoniae; Staphylococcus aureus; Escherichia coli; Klebsiella pneumoniae; P. aeruginosa с помощью скрининговых иммуноферментных тест-систем для определения IgG к условно-патогенным бактериям и «ИФА-IgG-АТ HIB» (ООО «Навина», Россия). Все дети не вакцинированы против H. influenzae типа b и S. pneumoniae. В мокроте (n=10), плевральном выпоте (n=10), БАЛ (n=25) у детей с обострением ХИВЗЛ и БАЛ (n=10) у детей без инфекционной бронхолегочной патологии ДНК H. influenzae и S. pneumoniae выявляли методом ПЦР с электрофоретической детекцией продуктов амплификации в агарозном геле «АмлиСенс Neisseria spp., Haemophilus spp., Streptococcus spp. - EPh», ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора, Москва. Методом ГЖХ исследована мокрота (n=10), плевральный выпот (n=10), БАЛ (n=25) у детей с обострением ХИВЗЛ и БАЛ (n=10) у детей без инфекционной бронхолегочной патологии. В пробах определяли: уксусную кислоту (С2); пропионовую кислоту (С3); изомасляную кислоту (iС4); масляную кислоту (С4); изовалериановую кислоту (iС5); валериановую кислоту (C5); изокапроновую кислоту (iC6); капроновую кислоту (C6) [2]. Статистическую обработку данных проводили с помощью программы STATISTICA ® версия 6.0.
Результаты
При комплексном использовании методов диагностики этиология обострений ХИВЗЛ у детей установлена в 88,6% случаев. Монокультуры (62,2%): аэробные, в том числе факультативно-анаэробные, бактерии (H. influenzae - 15,6%; S. pneumoniae - 6,7%; M. catarrhalis - 6,7%; S. aureus - 2,2%; C. pneumoniae - 4,4%; M. pneumoniae - 2,2%; L. pneumophila, серогруппа 1 - 2,2%), неспорообразующие анаэробные бактерии (Bacteroides spp. - 6,7%; Fusobacterium nucleatum - 6,7%; Peptostreptococcus spp. - 4,4%) и вирусы (Parainfluenza серотипы 1, 2, 3 - 2,2%; Influenza А - 2,2%), а ассоциации (26,4%): бактериально-бактериальные (S. pneumoniae+H. influenzae - 2,2%; M. pneumoniae+H. influenzae - 2,2%; Propionibacterium spp.+P. aeruginosa+E. coli - 4,4%; Bacteroides spp.+S. pneumoniae - 4,4%; Peptostreptococcus spp.+Bacteroides ureolyticus+S. aureus - 2,2%), бактериально-вирусные (Stenotrophomonas maltophilia+Influenza A - 4,4%; Enterobacter cloacae+Influenza B - 2,2%; Eubacterium spp.+Respiratory Syncytial Virus - 2,2%), бактериально-грибковые (E. coli+Candida glabrata+Candida krusei+Candida tropicalis - 2,2%). Обнаружение микробных ассоциаций при обострениях ХИВЗЛ приводит к необходимости оценки результатов их чувствительности только в совокупности. Так наличие в ассоциации одного из микроорганизмов, обладающего каким-либо механизмом резистентности к β-лактамам, которые наиболее часто используются как стартовые антибиотики, может привести к неудачам в терапии данным классом антимикробных препаратов. Также проведена оценка диагностической значимости примененных лабораторных методов в определении этиологической роли монокультур и микробных ассоциаций при обострениях ХИВЗЛ у детей. Установлено, что при использовании только культурального исследования возбудитель обнаружен у 51,1% пациентов. При этом лидируют следующие монокультуры микроорганизмов: на первом месте H. influenzae
- 15,6%, на втором S. pneumoniae - 6,7%, на третьем M. catarrhalis - 6,7%. В свою очередь, применение только метода непрямой иммунофлюоресценции (IgМ) позволило выявить патоген у 24,4% детей: C. pneumoniae (4,4%),
M. pneumoniae (4,4%), Respiratory Syncytial Virus (2,2%), Influenza A (6,7%), Influenza В (2,2%), Parainfluenza, серотипы 1, 2, 3 (2,2%), L. pneumophila, серогруппа 1 (2,2%). Во всех случаях IgМ выявлены только к одному из перечисленных выше возбудителей. В свою очередь IgG обнаруживались с большей частотой и к следующим микроорганизмам: M. pneumoniae (8,8%), C. pneumoniae (8,8%), Adenovirus (40%), Respiratory Syncytial Virus (57,8%), Influenza A (26,7%), Influenza В (31,1%), Parainfluenza, серотипы 1, 2, 3 (28,9%). Как правило, у пациентов одновременно встречались IgG к двум и более возбудителям - 53,3% случаев. У детей с обострением ХИВЗЛ наблюдалась сероконверсия IgG к: H. influenzae типа b в 15,6% случаев, бескапсульному штамму H. influenzae - 6,7%, S. pneumoniae - 11,1%, E. coli -2,2%, P. aeruginosa - 2,2%, S. aureus - 4,4%. При этом одновременное обнаружение сероконверсии IgG сразу к двум микроорганизмам, в том числе к H. influenzae типа b и бескапсульному штамму H. influenzae, выявлено у троих детей, таким образом, применение ИФА позволило достоверно подтвердить этиологическую роль возбудителя у 35,6% детей с обострением ХИВЗЛ. Одновременно ДНК H. influenzae и S. pneumoniae в БАЛ обнаружено у одного ребенка; всего методом ПЦР в материале из нижних дыхательных путей ДНК гемофильной палочки и пневмококка выявлены у 28,9% детей с обострением ХИВЗЛ. В БАЛ у детей без инфекционной бронхолегочной патологии ДНК H. influenzae и S. pneumoniae не обнаружена. Основными маркерами (метод ГЖХ), выделяемыми аэробными, в том числе и факультативно- анаэробными микроорганизмами, являются уксусная (С2), а анаэробными - пропионовая (С3) и масляная (С4) кислоты. Анаэробный индекс - это отношение суммы концентраций пропионовой и масляной кислот к уксусной кислоте. Результаты собственных исследований, подтвержденные посевами образцов на питательные среды и анализ данных литературы [1, 2] позволили установить, что увеличение уксусной кислоты и изокислот свидетельствуют о наличии в клиническом материале аэробных микроорганизмов. И наоборот преимущественное повышение пропионовой и/или масляной кислот, а следовательно, и смещение анаэробного индекса в более отрицательные значения указывают на анаэробы. При этом, например, преобладание в образцах пропионовой кислоты говорит в пользу присутствия в клиническом материале бактерий рода Bacteroides. В то время как превалирование масляной кислоты о более вероятном содержании бактерий рода Fusobacterium. Совместное повышение уксусной, пропионовой, масляной кислот и изомеров короткоцепочечных жирных кислот (КЖК) указывает на ассоциацию микроорганизмов (аэробных и анаэробных) в клиническом материале. Маркеры микроорганизмов обнаружены хроматографически у 84,5% детей. С одной стороны, хроматографический метод позволяет выявить обострения ХИВЗЛ, в которых принимают участие анаэробы - в 31% случаев, тогда как культуральный - только в 13,3% (p=0,03). Но, с другой стороны, достоверных различий в обнаружении аэробных бактерий данными методами нет (p>0,05).
Выводы
Примененные методы позволили установить этиологию инфекции в 88,6% случаев обострений ХИВЗЛ, из них ассоциации микроорганизмов - 26,4%, а в монокультуре - 62,2%. При этом неспорообразующие анаэробы вызывают обострение ХИВЗЛ в 31% случаев, среди которых превалируют как в монокультуре, так и в составе ассоциаций Bacteroides spp.
Список литературы
1. Белобородова Н.В., Курчавов В.А., Бойко Н.Б. и др. Диагностика анаэробной инфекции у детей методом хроматографии: Метод. рекомендации. - URL:
http://www. rusmedserv.com/microbiology/mikrdiag/article_10.html.
2. Минушкин О.Н., Ардатская М.Д., Иконников Н.С. Способ определения короткоцепочечных жирных кислот (фракции С2‑С6 с изомерами) в различных биологических субстратах методом газожидкостной хроматографии: Метод. рекомендации // Российская медицинская академия последипломного образования.
- М., 2005. - 61 с.
3. Murphy T.F., Bakaletz L.O., Smeesters P.R. Microbial interaction in the respiratory tract // Pediatr. Journal Infect. Dis. - 2009. - Vol. 28, Suppl. 10. - P. 121-126.
