АУТОКАТАЛИТИЧЕСКИЕ ЭФФЕКТЫ ЛИЗОСОМАЛЬНЫХ ЦИСТЕИНОВЫХ ПРОТЕИНАЗ МЫШЕЧНЫХ ТКАНЕЙ ПОД ДЕЙСТВИЕМ L-АРГИНИНА

Катепсины В (KB), L (KL), и Н (KН) принадлежат к группе цистеиновых лизосомальных протеиназ, принимают участие во многих процессах в организме. KB, KL, и KН, синтезируются рибосомами в виде препроэнзима. После прохождения через эндоплазматический ретикулум препетид отделяется и прокатепсин подвергается протеолитическому превращению в активную, зрелую форму фермента в кислотной среде поздних эндосом или в лизосомах, где основной функцией катепсинов считается деградация белков. Лимитированный протеолиз, таким образом, является критическим этапом для контроля протеолитической активности катепсинов [7].
В настоящее время широко известно, что протеолитическому отщеплению пропептида способствуют в том числе и цистеиновые протеиназы [1, 8]. В последние годы исследования сконцентрировались на изучении аутокаталитического процессинга лизосомальных протеаз в кислой среде, так как снижение рН, предположительно, ослабляет взаимодействие между пропептидом и каталитической частью молекулы, что было показано на примере взаимодействия KB и KL с их пропетидами [4, 10]. Как следствие, профермент, вероятно, претерпевает конформационные изменения в результате которых связь пропептида с активным центром ослабляется при сохранной вторичной структуре [9]. Так же одним из механизмов может являться расширение места активного центра за счет изменения рН, что было показано для зрелого папаина, смещения пропептида окклюзионной петлей, как это уже было предложено для KB, и/или небольшими локальными структурными изменениями в пропептиде, что имеет место у KL [10].
Следует отметить, что процесс аутоактивации KB и KL значительно ускоряется в присутствии различных гликозаминогликанов [9, 5]. Так как гликозаминогликаны (мукополисахариды) в процессе метаболизма сосредотачиваются в лизосомах [11], они могут быть вовлечены в процессинг цистеиновых протеиназ in vivo за счет ослабления взаимодействий между пропептидом и каталитической частью молекулы.
К настоящему времени, аутокаталитический механизм активации был описан для многих цистеиновых протеиназ: KB [8, 9] и KL [6]. Следует отметить, что в ранних работах посвященных изучению процессинга прокатепсинов был предположен внутримолекулярный механизм аутокаталитической активации цистеиновых протеиназ, однако эта гипотеза была опровергнута исследованиями кристальных структур прокатепсинов В, L, которые показали локализацию пропептида в положении блокирующем доступ к активному центру фермента и более того, его расположение в направлении противоположном для связывающегося субстрата [10]. Дополнительные доказательства межмолекулярного механизма данной реакции были получены при более поздних исследованиях KL [6], а также в работе использующей KB в виде модели[9]. В ряде исследований доказано, что активация прокатепсина Н является аутокаталитическим процессом, не требующим присутствия других протеиназ и заметно ускоряющимся в присутствии гликозаминогликанов [1].
Материалы и методы
Работа выполнена на 12 конвенциональных половозрелых крысах-самцах линии Wistar массой 280-320 граммов. Моделирование изменения уровня синтеза оксида азота (II) субстратом NO-синтазы в экспериментальной группе (n=6), осуществляли путем внутрижелудочного введения в течение 10 дней раствора L-аргинина («Sigma», США) на 0,9 % растворе NaCl в дозе 500 мг/кг [2]. Контрольной группе (n=6) параллельно вводили физиологический раствор.
В работе руководствовались «Международными рекомендациями по проведению медико-биологических исследований с использованием животных» (1985) и приказом МЗ РФ №267 от 19.06.2003 г. «Об утверждении правил лабораторной практики».
Активность лизосомальных цистеиновых протеиназ в седиментируемой (СА) и неседиментируемой (НСА) фракциях гомогената сердечной, скелетной мышцы и участка грудной аорты определяли раздельно. Активность КВ, КL и КН изучалась спектрофлуориметрическим методом по Barrett & Kirschke [3].
Коэффициент аутокаталитического действия катепсинов 1 (Каса1) рассчитывался как отношение значения активности фермента после прекаталитической инкубации в отсутствии субстрата к параллельно определяемому значению активности без преинкубации. Коэффициент аутокаталитического действия катепсинов 2 (Каса2) рассчитывался как отношение разницы значений между активностью фермента после прекаталитической инкубации и активностью без преинкубации к параллельно определяемому значению активности без преинкубации.
Статистический анализ проведен с использованием программы «Statistica 10.0». Вычисляли медиану (Ме), минимальное (min) и максимальное (max) значение (Ме [min; max]), для оценки статистической значимости использовали критерий Манна-Уитни (U-тест).
Результаты и их обсуждение
Согласно данным, полученным в результате эксперимента, можно наблюдать в лизосомальной и внелизомальной фракциях однонаправленное изменение Каса1 и Каса2 изучаемых катепсинов.

Таблица 1

Коэффициенты аутокаталитического действия катепсинов В, L и Н

Примечание:*- статистически значимые отличия от группы контроля (р<0,05)

В сердечной мышце статистически значимое нарастание показателей Каса1 и Каса2 для КВ как в седиментируемой, так и в неседиментируемой фракциях на фоне L-аргинина свидетельствует о существенном увеличении количества неактивных молекул фермента в лизосомах и цитоплазме в описываемых условиях. Изменения коэффициентов аутокаталитического действия для КL и КН в сердечной мышце оказались статистически не значимыми.
В скелетной мышце, напротив, отмечается статистически значимое снижение показателей Каса1 и Каса2 для КВ в седиментируемой и в неседиментируемой фракциях, что может быть результатом практически полного отсутствия проферментных форм катепсина в лизосомах и цитоплазме. В этом случае, возможно, аутокаталитическое воздействие приводит к расщеплению самого фермента и количество активных молекул снижается. В то же время, для КL в данной ткани получено статистически значимое нарастание коэффициентов в седиментируемой (лизосомальной) фракции.
Наименьшие изменения коэффициентов аутокаталитического действия зарегистрированы в грудной аорте: статистически значимыми оказались только изменения показателей Каса1 и Каса2 для КВ в неседиментируемой фракции.
Таким образом, введение субстрата синтеза NO L-аргинина приводит к изменению содержания в мышечных тканых проферментных и активных форм лизосомальных цистеиновых катепсинов; наибольшей чувствительностью при этом обладает КВ.
Выводы
1. L-аргинин вызывает нарастание количества проферментных форм КВ в миокарде с параллельным снижением их содержания в скелетной мышце.
2. Для КL на фоне L-аргинина обнаруживается только нарастание проферментных форм в седиментируемой фракции скелетной мышцы.
3. Ткань грудной аорты демонстрирует минимальные изменения аутокаталитического процессинга лизосомальных цистеновых катепсинов на фоне L-аргинина.

Список литературы

1. Васильева О.С. Изучение механизма аутокаталитической активации прокатепсина H in vitro [Электронный ресурс]./ О.С. Васильева, В.Ю. Серебров, Б. Турк, В. Турк // Исследовано в России: Российский электронный журнал – 2002 – Т.5 - С.1092-1102- Режим доступа: http://zhurnal.ape.relarn.ru/ (15.08.2014)
2. Покровский М.В. Эндотелиопротекторные эффекты L-аргинина при моделировании дефицита окиси азота. / М.В. Покровский, Т.Г. Покровская, В.И. Корчаков [и др.] // Экспериментальная и клиническая фармакология. – 2008. – Т.71- № 2. – С. 29–31.
3. Barrett A.J. Cathepsin B, Cathepsin H, cathepsin L / A.J. Barrett., H. Kirschke // Methods in Enzymol. – 1981. – Vol. 80. – P. 535-561.
4. Fox T. Potent slow-binding inhibition of cathepsin B by its propeptide / Т.Fox , Е. de Miguel, J.S Mort, А.С. Storer // Biochemistry - 1992. - Vol. 31. - P. 12571-12576.
5. Ishidoh K. Procathepsin L degrades extracellular matrix proteins in the presence of glycosaminoglycans in vitro / К. Ishidoh, Е. Kominami // Biochem Biophys Res Commun. - 1995. - Vol. 217. - P. 624-31.
6. Menard R. Autocatalytic processing of recombinant human procathepsin L. Contribution of both intermolecular and unimolecular events in the processing of procathepsin L in vitro / R. Menard, E. Carmona, S. Takebe et al. // J Biol Chem. - 1998. - Vol. 273. - N8. - P. 4478-4484.
7. Neurath H. Evolution of proteolytic enzymes / Н. Neurath // Science. - 1984. - Vol. 224. - P. 350-357
8. Rowan A.D. Rat procathepsin B. Proteolytic processing to the mature form in vitro / A.D. Rowan, Р. Mason, L. Mach, J.S. Mort// J Biol Chem. - 1992. - Vol 267. - P. 15993-15999.
9. Rozman J. Autocatalytic processing of recombinant human procathepsin B is a bimolecular process / J. Rozman, J. Stojan, R. Kuhelj, V. Turk, B. Turk// FEBS Lett.- Vol. 459. - P. 358-362.
10. Turk B. Lysosomal cysteine proteases: more than scavengers / В. Turk, D. Turk, V. Turk // Biochim.Biophys. Acta.- 2000. - Vol. 1477. - P. 98-111.
11. Winchester B. The molecular basis of lysosomal storage diseases and their treatment / В. Winchester, А. Vellodi, Е. Young.// Biochem Soc Trans. - 2000. - Vol. 28. - N2. - P. 150-154. Review.