19 октября 2017г.
Ключевые слова: АЧС, африканская чума свиней, ТФ ИФА, иммуноферментный анализ, антиген.
Keywords: ASF, African swine fever, ELISA, enzyme linked immunosorbent assay, antigen.
Введение. Африканская чума свиней (АЧС) – контагиозная септическая болезнь всех видов домашних свиней и диких кабанов. Болезнь проявляется остро, подостро, хронически и бессимптомно, и характеризуется лихорадкой, геморрагическим диатезом, воспалительными изменениями паренхиматозных органов [1,2].
В отсутствии эффективных вакцин обнаружение в пробах биоматериала антител или участка ДНК вируса АЧС позволяет с
уверенностью говорить об инфекционном процессе, поэтому в лабораторной диагностике заболевания используются как прямые методы, направленные на выявление генетического материала или антигенов вируса, так и косвенные методы обнаружения вирусспецифических антител.
Ежегодно справочная лаборатория по африканской чуме свиней (CISA-INIA, Мадрид, Испания)
Европейского Союза (ЕС) для проверки компетенции и уровня подготовки специалистов диагностических лабораторий ЕС и других заинтересованных стран организует проведение международных межлабораторных сличительных испытаний (МСИ) по диагностике АЧС. Принимающим участие организациям рассылаются зашифрованные панели образцов патматериала и сывороток крови.
Ключевым компонентом диагностических тест систем для выявления антител является используемый антиген. Чувствительность и специфичность диагностической тест-системы во многом зависит от его качества, поэтому в 2016 году в референтной лаборатория по АЧС ФГБУ «ВНИИЗЖ» на образцах сывороток панели МСИ проводили исследование пригодности разработанного комплексного антигена вируса АЧС для его использования в ТФ ИФА, а также сравнения полученных результатов
с результатами анализов полученными при использовании коммерческих наборов.
Материалы и методы. Образцы: панель замороженных шифрованных сывороток крови в количестве 12 штук, полученная из справочной лаборатории по африканской чуме свиней ЕС. Подробное описание образцов указано в таблице 1.
ИФА: выявление антител к антигенам вируса АЧС
проводили
коммерческим набором ID Screen для непрямого ТФ ИФА (производитель IDVet, Франция) и с использованием метода ТФ ИФА на основе комплексного антигена (смесь очищенного вируса и рекомбинантного белка р30), разработанного в референтной лаборатории по АЧС ФГБУ «ВНИИЗЖ».
Для подтверждения результатов методом иммуноблоттинга использовали коммерческие тест- полосы с перенесённым на них разделённым в полиакриламидном геле препаратом частично очищенного цельного вируса (производитель CISA-INIA) в соответствии с инструкцией производителя.
Таблица 1.
Описание панели образцов
Шифр
|
Клин.
форма
|
Вирулентность
|
Изолят
|
Геноти
п
|
ДПЗ
|
Описание способа заражения
|
Сыворотки
|
С1
|
Острая
|
Вирулентный
|
L60 (Португалия)
|
I
|
5
|
в/м 105 ГАдЕ/мл
|
С2
|
Острая
|
Вирулентный
|
Ken06.Bus
(Кения)
|
IX
|
12
|
в/м 105 ГАдЕ/мл
|
С3
|
Образец от
интактной свиньи
|
С4
|
Острая
|
Вирулентный
|
NH/P68
(Португалия)-L60 (Португалия)-
Arm07 (Армения)
|
I-II
|
9 после
контроль- ного
заражения
|
NH/P68 в/м 105ТЦД50/мл +
в/м L60
10 ГАдЕ/мл + Arm07
10 ГАдЕ/мл.
Сыворотка получена на 9 день после
Arm07
|
С5
|
Хрони-
ческая
|
Аттенуирован-
ный
|
NH/P68
(Португалия)-L60 (Португалия)-
Arm07
(Армения)
|
I-II
|
63 после
контрольно
го заражения
|
NH/P68 в/м 105ТЦД50/мл +
в/м L60
10 ГАдЕ/мл + Arm07
10 ГАдЕ/мл. Сыворотка
получена на 63 день после
Arm07
|
С6
|
Образец от
интактной свиньи
|
С7
|
Образец от
интактной свиньи
|
С8
|
Острая
|
Вирулентный
|
LT14/1492 (Литва)
|
II
|
21
|
От свиньи,
содержащейся в
контакте со
свиньями которым в/м
инъецировали
LT14/1492 в дозе 10 ГАдЕ/мл
|
С9
|
Острая
|
Вирулентный
|
Arm07 (Армения)
|
II
|
7
|
Arm07 10 ГАдЕ/мл
|
С10
|
Хрони-
ческая
|
Аттенуирован-
ный
|
NH/P68
(Португалия)-
Arm07 (Армения)
|
I-II
|
126
|
NH/P68 в/м 102 ТЦД50/мл +
Arm07 10 ГАдЕ/мл.
|
С11
|
Хрони-
ческая
|
Аттенуирован-
ный
|
NH/P68
(Португалия)-
Arm07 (Армения)
|
I-II
|
65
|
NH/P68 в/м 102 ТЦД50/мл +
Arm07 10 ГАдЕ/мл.
|
С12
|
Образец от
интактной свиньи
|
С –
сыворотка;
ДПЗ – день после заражения;
ТЦД – тканевая цитопатогенная доза;
ГАдЕ
– гемадсорбирующая единица
Результаты
и обсуждение. Все серологические методы,
которыми исследовали панель образцов,
как
в справочной лаборатории ЕС, так и в референтной лаборатории по АЧС ФГБУ «ВНИИЗЖ» показали одинаковые результаты для 11 из 12 сывороток (таблица 2). Из них антитела к антигенам вируса АЧС выявлялись в сыворотках номер 4, 5, 10 и 11. Анализ результатов показал, что современные коммерческие наборы в данных условиях имели сравнимую чувствительность и специфичность. Однако коммерческие наборы на основе ТФ ИФА продемонстрировали меньшую чувствительность в сравнении с иммуноцитохимическим методом.
Таблица 2. Серологические исследования
|
|
С1
|
С2
|
С3
|
С4
|
С5
|
С6
|
С7
|
С8
|
С9
|
С10
|
С11
|
С12
|
ЕС
|
МЭБ-ИФА
|
-
|
-
|
-
|
+
|
+
|
-
|
-
|
-
|
л. о.
|
+
|
+
|
-
|
Ingenasa
K3
|
-
|
-
|
-
|
+
|
+
|
-
|
-
|
-
|
л.
о.
|
+
|
+
|
-
|
IDVet
|
-
|
-
|
-
|
+
|
+
|
-
|
-
|
-
|
сомн
|
+
|
+
|
-
|
АЧС
|
IDVet
|
-
|
-
|
-
|
+
|
+
|
-
|
-
|
-
|
сомн
|
+
|
+
|
-
|
РЛАЧС-ИФА
|
-
|
-
|
-
|
+
|
+
|
-
|
-
|
-
|
+
|
+
|
+
|
-
|
|
|
Подтверждающие
тесты
|
ЕС
|
ИБ
|
-
|
-
|
-
|
+
|
+
|
-
|
-
|
-
|
л.
о.
|
+
|
+
|
-
|
ИЦХ
|
-
|
-
|
-
|
+
|
+
|
-
|
-
|
-
|
+
|
+
|
+
|
-
|
АЧС
|
ИБ
|
-
|
-
|
-
|
+
|
+
|
-
|
-
|
-
|
+
|
+
|
+
|
-
|
|
Заключение
|
Заключение ЕС
|
-
|
-
|
-
|
+
|
+
|
-
|
-
|
-
|
сл.
пол
|
+
|
+
|
-
|
Заключение АЧС
|
-
|
-
|
-
|
+
|
+
|
-
|
-
|
-
|
+
|
+
|
+
|
-
|
С –
сыворотка
«-» – отрицательно
«+» - положительно
л.о. -
ложноотрицательно
сл. пол – слабоположительно сомн.
– сомнительный результат
АЧС – референтная лаборатория по АЧС ФГБУ «ВНИИЗЖ»
ЕС - справочная лаборатория по АЧС
Европейского Союза РЛАЧС-ИФА – тест система реф.
лаб.
по АЧС
МЭБ-ИФА – непрямой
ТФ
ИФА, описанный в Руководстве по диагностике АЧС (раздел 2.8.1.,
2012 год)
Ingenasa K3 – коммерческий блокирующий ТФ ИФА Ingezim PPA Compac (11.PPA k3), основанный
на P72 IDVet – коммерческий ТФ ИФА набор ID Screen, основанный на рекомбинантных P32, P62 и P72
ИБ – иммуноблоттинг,
описанный в Руководстве по диагностике АЧС (раздел 2.8.1., 2012 год)
ИЦХ – непрямой
иммуноцитохимический метод на основе инфицированных изолятом E70М, согласно протоколу
справочной лаборатории по АЧС Европейского Союза
Различия наблюдались только для образца №9, который справочная лаборатория обозначили как слабоположительный. Данный
образец отобран на 7 день после заражения, что, сообразно механизму выработки иммунного ответа, является сроком часто недостаточным для успешного образования высокоспецифичных антител в выявляемых количествах. Тест-системы, использующие в качестве компонентов антигена белки, накапливаемые в больших количествах на ранние сроки после интернализации вируса, имеют преимущества при исследовании таких образцов. Например, белок р30 (также называемый p32 или продуктом экспрессии гена CP204L), ответственный за интернализацию вируса в клетку и индуцирующий развитие гуморального и клеточного иммунного ответа в in vitro инфицированных клетках, выявляется на более ранних сроках, чем некоторые другие вирусные белки [5]. Это позволяет тест- системам, направленным на выявление антител к этому белку, иметь более высокую чувствительность на ранних стадиях инфекции, по сравнению с методами, направленными на выявление антител к антигенам очищенного вируса или белкам, продуцируемым на более поздних стадиях инфекции [5]. Так, справочная лаборатория ЕС при исследовании сыворотки №9 получила ложноотрицательные результаты при применении набора Ingezim PPA Compac, использующем в качестве антигена рекомбинантный белок p72, и в методе ТФ ИФА, описанном МЭБ, в котором используется препарат частично очищенного вируса.
В референтной лаборатории по АЧС ФГБУ «ВНИИЗЖ» для исследования панели образцов использовали коммерческий набор IDVet и получили результаты, аналогичные результатам, полученным в справочной лаборатории европейского союза при использовании
того
же
диагностического набора (таблица 3). Сыворотки также были исследованы в экспериментальной тест-системе референтной лаборатории ФГБУ «ВНИИЗЖ» по АЧС для определения чувствительности и специфичности используемого комплексного антигена (таблица 3). В исследованиях положительными считали сыворотки с оптической плотностью субстратного раствора в лунке в 2,1 и более раза выше оптической плотности отрицательного контроля. Полученные результаты согласуются с результатами справочной лаборатории ЕС. Это указывает на то, что полученный антиген, при использовании его в качестве компонента тест-системы, позволяет получить высокую чувствительность и специфичность.
Таблица 3. Оптическая плотность субстрата в экспериментальной тест-системе референтной лаборатории по АЧС
|
К-
|
С1
|
С2
|
С3
|
С4
|
С5
|
С6
|
С7
|
С8
|
С9
|
С10
|
С11
|
С12
|
ОП
450
|
0,09
|
0,09
|
0,07
|
0,07
|
0,86
|
0,91
|
0,05
|
0,04
|
0,08
|
0,36
|
0,52
|
0,37
|
0,06
|
0,16
|
0,08
|
0,08
|
0,06
|
0,83
|
0,81
|
0,05
|
0,05
|
0,09
|
0,22
|
0,71
|
0,34
|
0,06
|
ЕС
|
|
-
|
-
|
-
|
+
|
+
|
-
|
-
|
-
|
сл. пол
|
+
|
+
|
-
|
АЧС
|
|
-
|
-
|
-
|
+
|
+
|
-
|
-
|
-
|
+
|
+
|
+
|
-
|
С
– сыворотка
«-»
– отрицательно
«+»
- положительно
сл. пол – слабоположительно
«К-»
- отрицательный
контроль
«К+»
- положительный контроль
ОП450 – оптическая плотность субстрата
при длине волны 450 нм
ЕС – заключение справочной
лаборатории по АЧС Европейского Союза
АЧС – заключение референтной лаборатория по АЧС ФГБУ «ВНИИЗЖ»
Результаты
иммуноблотинга. На блотограмме (рис. 1) панели образцов видно, что сыворотки под номерами 4, 5, 10 и 11 реагируют более чем с одним белком и имеют специфический паттерн окраски продукта реакции исследуемых сывороток с вирусными белками,
схожий
с паттерном окраски контрольной положительной сыворотки (не представлена). Остальные образцы имеют единичные окрашенные полосы неспецифического взаимодействия аналогичные тем, которые наблюдались для отрицательного контроля в данной реакции (не представлен на рисунке). Образец номер 9 помимо этого имеет дополнительную окрашенную полосу, что, согласно стандартной операционной процедуре справочной лаборатории ЕС, может являться визуализацией антител против ранних белков вируса АЧС, например, р12 или р30 [4].
Заключение.
Комплексный
антиген, полученный
в
референтной
лаборатории
по АЧС ФГБУ «ВНИИЗЖ»,
пригоден для использования при разработке тест-систем для выявления
антител к вирусу АЧС в ТФ ИФА. Метод ТФ ИФА с использованием данного антигена показал на панели референтных образцов чувствительность и специфичность, сравнимую с коммерческими тест-системами. Метод ТФ ИФА с использованием комплексного антигена при исследовании данных референтных образцов позволяет выявлять антитела к антигенам вируса АЧС, начиная с 7 дня после инфицирования.
Список литературы
1.
Ремыга, С.Г. Клинические и патологоанатомические изменения у диких европейских кабанов и домашних свиней при заражении вирусом африканской чумы свиней / С.Г. Ремыга, А.С. Першин, И.В. Шевченко [и др.] // Ветеринария Сегодня. – 2016. – № 3 (18). – c. 46–51.
2.
Шевченко, И.А. Клинико-анатомическое проявление африканской чумы свиней при заражении разными методами вирусом, выделенным от дикого кабана / И. В. Шевченко, С. Г. Ремыга, А.С. Першин [и др.] // Современные проблемы пат. анатомии, патогенеза и диагностики болезней животных: материалы 18-й Междунар. научно-методич. конф. - М., 2014. - С.82-84.
3.
Afonso, C.L. Characterization of P30, a highly antigenic membrane and secreted protein of African Swine Fever Virus / C. L. Afonso, C. Alcaraz, A. Brun [et al] // Virology. – 1992. - Vol. 189. – p. 368–373.
4.
Standard operating procedure for the detection of antibodies against african swine fever by immunoblotting // Centro de investigation en sanidad animal (CISA-INIA) European Union Reference Laboratory for ASF, (EURL-ASF). - rev. 2013 - p. 1-7.
5.
Pérez-Filgueira, D.M. Optimization and validation of recombinant serological tests for African Swine Fever diagnosis based on detection of the p30 protein produced in Trichoplusia ni larvae / D.M. Pérez-Filgueira, F.
González-Camacho, C. Gallardo
[et al] //J Clin Microbiol. – 2006. – vol. 44. – P. 3114- 3121.