АКТИВНОСТЬ ФЕРМЕНТОВ СИСТЕМЫ ГЛУТАТИОНА В ПОЧКАХ КРЫС ПРИ ЧРЕЗМЕРНЫХ ФИЗИЧЕСКИХ НАГРУЗКАХ В СОЧЕТАНИИ С ОСТРОЙ ИНТОКСИКАЦИЕЙ ЭТАНОЛОМ

Аннотация. Исследование было проведено на 79 крысах-самцах, которых делили на шесть групп (n=10-15): 1-ю группу составили интактные крысы; 2-ю группу – контрольные животные, которые плавали без груза по усредненному времени (3–5 мин.); 3-ю – контрольные крысы, получавшие физиологический раствор вместо этанола; 4-ю – крысы, подвергнутые чрезмерным физическим нагрузкам; 5-ю – крысы, получавшие этанол; 6-ю – крысы, подвергнутые чрезмерным физическим нагрузкам в сочетании с острой интоксикацией этанолом. После завершения эксперимента в почках крыс определяли содержание глутатиона, активность глутатионпероксидазы, глутатионредуктазы, глутатион-S-трансферазы и гамма- глутамилтрансферазы. Установлено, что острая интоксикация этанолом на фоне чрезмерных физических нагрузок приводят к снижению уровня глутатиона в тканях почек крыс. Активность глутатионпероксидазы и глутатионредуктазы в этих условиях снижена на фоне повышения активности глутатион-S-трансферазы и гамма-глутамилтрансферазы. Уменьшение содержания глутатиона и изменение активности ферментов его обмена в почках крыс свидетельствуют о нарушении функции антиоксидантной системы при чрезмерных физических нагрузках в сочетании с острой интоксикацией этанолом.

Ключевые слова: глутатион, антиоксидантная система, физические нагрузки, этанол, почки, крысы.

Введение. Научная литература содержит достаточно данных о вреде физических нагрузок высокой интенсивности, в частности, об их влиянии на биохимические процессы в различных органах [4, 6, 10, 11, 13], в том числе и почках [11]. Несмотря на это наблюдается дефицит исследований, занимающихся выявлением особенностей сочетанного воздействия на организм человека чрезмерных физических нагрузок с другими факторами. Одним из таких факторов может быть острая интоксикация этанолом, так как злоупотреблению спиртными напитками не редко предшествует интенсивная физическая работа. В связи с этим, актуальным является изучение физиологических процессов, происходящих в организме, и в органах выделительной системы в частности, при одновременном действии на него чрезмерных физических нагрузок и острой интоксикации этанолом.

Важным звеном метаболизма является антиоксидантная система. Она защищает клетки от свободных радикалов и продуктов перекисного окисления липидов и белков. Глутатионовая антиоксидантная система является составной частью антирадикальной и антиперекисной защиты клеток и состоит из ферментов, участвующих в редокс-цикле глутатиона, а также энзимов, использующих глутатион или образующие его аминокислоты для коньюгирования различных веществ.

Цель исследования: Оценить состояние системы глутатиона в почках крыс, подвергнутых чрезмерным физическим нагрузкам в сочетании с острой алкогольной интоксикацией.

Материал и методы. Исследования проводились на кафедре биохимии Омского государственного медицинского университета в 2012–2015 гг. В качестве экспериментальных животных были использованы 79 белых крыс-самцов массой 180–200 г. Методом случайной выборки крыс делили на 6 групп: 1-ю группу составили интактные крысы (n=15); 2-ю группу – контрольные животные, которые плавали без груза по усредненному времени (3–5 мин.) (n=15); 3-ю – контрольные крысы, получавшие физиологический раствор вместо этанола (n=15); 4-ю – крысы, подвергнутые чрезмерным физическим нагрузкам по методу В.В. Корняковой с соавт., 2007 [5], плававшие с грузом 10% от массы тела до полного утомления (n=12); 5-ю – крысы, получавшие этанол (n=10); 6-ю – крысы, подвергнутые чрезмерным физическим нагрузкам в сочетании с острой алкогольной интоксикацией (n=12). Введение этанола крысам 5 и 6-й групп осуществлялось перорально при помощи металлического катетера в дозе 4 г/кг массы тела. При этом необходимо отметить, что крысы 6-й группы получали этанол после развития у них чрезмерных физических нагрузок. По истечению двух часов после введения этанола, животных выводили из эксперимента.

Температура воздуха в виварии составляла 19–21, воды при плавании – 28–30оС. При проведении

эксперимента соблюдались требования Европейской конвенции по защите позвоночных животных, применяемых для экспериментальных и других научных целей 86/609 EEC.

После завершения эксперимента проводилось извлечение почек, которые позднее подвергались гомогенизации на 0,15 М растворе хлорида калия (KCl) в стеклянном гомогенизаторе Поттера при температуре 0–2оС. В супернатанте гомогенатов определяли содержание общего белка при помощи биуретового реактива и глутатиона по Н.А. Костромитикову, Е.А. Суменкову, 2005 [7]. Данный метод основан на реакции восстановленного глутатиона с реактивом Эллмана, в результате которого образуется тионитрофенольный анион, и под его воздействием меняется цвет раствора, приобретая желтый оттенок. Активность глутатионпероксидазы (КФ 1.11.1.9) и глутатионредуктазы (КФ 1.6.4.2) определяли по С.Н. Власовой с соавт., 1990 [2], глутатион-S-трансферазы (ГSТ, КФ 2.5.1.1.8) по Habig and Jakoby, 1981 [12] и гамма-глутамилтрансферазы (ГГТ, КФ 2.3.2.2) по Persijn and van der Slik [14].

Статистическую обработку полученных данных проводили с использованием программы Statistica 6.0 фирмы «StatSoft Inc.» (США). Экспериментальные данные обрабатывали при помощи непараметрического U–критерия Манна–Уитни. Результаты представлены как Ме – медиана, Q1 – нижний квартиль, Q3 – верхний квартиль.

Результаты исследования и их обсуждение. Эксперимент показал, что изучаемые биохимические показатели у животных контрольных (2 и 3-й) групп не имеют статистически значимых различий по сравнению с интактными крысами. Чрезмерные физические нагрузки вызвали снижение концентрации глутатиона в почках крыс и изменение активности ферментов, участвующих в его метаболизме. Содержание глутатиона в почках животных 4-й группы снижено в 2,04 раза относительно аналогичного показателя во 2- й группе (табл. 1). Снижение концентрации трипептида у крыс с чрезмерными физическими нагрузками обусловлено развитием в почках острого нарушения метаболизма пуринов, сопряженного с усиленной генерацией активированных кислородных метаболитов (АКМ) в ксантиноксидазной реакции [11]. Острое нарушение метаболизма пуринов – это процесс, характеризующийся повреждением нуклеиновых кислот, нарушением энергетического обмена с последующим накоплением АМФ, запускающим процесс катаболизма пуриновых мононуклеотидов до урата [4, 6, 10]. Одним из негативных последствий острого нарушения метаболизма пуринов является активация ксантиноксидазы. Данный энзим активно генерирует АКМ, которые способны повреждать липиды, белки, а также нуклеиновые кислоты. Атака АКМ на липиды мембранных структур клетки приводит к накоплению в них продуктов перекисного окисления липидов.

Таблица 1.

Изменение биохимических показателей в почках крыс, подвергнутых острой интоксикации этанолом на фоне чрезмерных физических нагрузок, Me (Q1–Q3)

Группа	Показатель
	Глутатион, нмоль/мг белка	Глутатионпероксидаза, МЕ/мг белка	Глутатионредуктаза, МЕ/мг белка
1-я	14,9	378	288
n=15	(8,24–21,1)	(271–489)	(171–365)
2-я	15,7	395	258
n=15	(8,31–22,5)	(282–476)	(144–386)
3-я	15,1	359	270
n=15	(9,80–24,5)	(263–475)	(180–357)
4-я	7,30	149	93,8
	(2,40–12,4)	(87,6–206)	(72,9–126)
n=12	p[1]=0,00015	p[1]=0,00001	p[1]=0,00001
	p[2]=0,00009	p[2]=0,00001	p[2]=0,00001
5-я	19,2	558	345
	(5,73–16,5)	(432-723)	(264–635)
n=10	p[1]=0,01357	p[1]=0,00018	p[1]=0,01161
	p[3]=0,00300	p[3]=0,00028	p[3]=0,00714
6-я n=12	5,90	107	70,9
	(1,52–10,4) p[1]=0,00007 p[4]=0,17964	(60,3–161) p[1]=0,00001 p[4]=0,05704	(35,2–116) p[1]=0,00001 p[4]=0,02811
	p[5]=0,01341	p[5]=0,00009	p[5]=0,00009

 

Примечание: (здесь и в табл. 2) p[1] – различия статистически значимы с 1-й группой; p[2] – со 2-й группой; p[3] – с 3-й группой; p[4] – с 4-й группой; p[5] – с 5-й группой.

Чрезмерные физические нагрузки у крыс 4-й группы вызвали снижение активности глутатионпероксидазы и глутатионредуктазы на фоне активации глутатион-S-трансферазы и гамма- глутамилтрансферазы. Показатель глутатионпероксидазы в 2,65, а глутатионредуктазы в 2,75 раза ниже относительно аналогичного показателя 2-й группы (табл. 1). Снижение активности глутатионпероксидазы и глутатионредуктазы может быть вызвано ингибированием ферментов продуктами реакции, а также меньшей стимуляцией экспрессии данных белков под влиянием антиоксидант-респонсивного элемента (ARE). Еще одной причиной снижения активности этих ферментов in vivo может быть дефицит селена [1, 8, 9].

Активность глутатион-S-трансферазы в почках крыс 4-й группы оказалась выше в 1,63 раза относительно аналогичного показателя 2 группы (табл. 2), что свидетельствует об интенсивном включении глутатион-S-трансферазы в процессы инактивации продуктов свободнорадикального окисления. Образовавшиеся глутатион-S-конъюгаты в результате реакции, катализируемой глутатион-S-трансферазой, подвергаются дальнейшему изменению под действием ряда ферментов, одним из которых является гамма- глутамилтрансфераза. Активность этого энзима у крыс 4-й группы была выше в 2,18 раза относительно аналогичных показателей 2-й группы.

Таблица 2.

Изменение биохимических показателей в почках крыс, подвергнутых острой интоксикации этанолом на фоне чрезмерных физических нагрузок, Me (Q1–Q3)

Группа	Показатель
	Глутатион-S-трансфераза, МЕ/г белка	Гамма-глутамилтрансфераза, МЕ/мг белка

1-я n=15   1,12 (0,76–1,97) 430 (290–537) 2-я n=15 1,05 (0,73–2,01) 435 (289–536) 3-я n=15 1,14 (0,79–1,83) 429 (287–525)   4-я n=12 1,71 (1,21–2,36) p  =0,00049 p[2]=0,00229 959 (764–1146) p  =0,00001 p[2]=0,00001   5-я n=10 1,59 (1,17–2,19) p[1]=0,01840 p[3]=0,00714 601 (434–839) p[1]=0,00107 p[3]=0,00118   6-я 1,85 (1,55–2,47) 1154 (947–1553) p[1]=0,00007 p[1]=0,00001 n=12 p[4]=0,14892 p[4]=0,00456 p[5]=0,06021 p[5]=0,00005

Острая интоксикация этанолом у крыс 5-й группы так же, как и чрезмерные физические нагрузки у крыс 4-й группы приводит к снижению содержания глутатиона в почках. Уровень этого метаболита в гомогенатах почек крыс 5-й группы был в 1,27 раза ниже относительно аналогичного показателя в 3-й группе. Это может быть связано с интенсивным вовлечением данного трипептида в реакции конъюгации с продуктами свободно-радикального окисления, образующимися в результате действия острой алкогольной интоксикации. Источниками АКМ при острой интоксикации этанолом могут быть различные ферментативные реакции как с участием самого этанола, так и с участием ацетальдегида, образующегося из этого спирта под действием алкогольдегидрогеназы [3]. Кроме того, усиленное образование кетоновых тел из-за избытка ацетил-КоА и NADH приводит к развитию кетоацидоза, способствующего интенсификации процессов острого нарушения метаболизма пуринов.

Снижения уровня восстановленного глутатиона в почках животных, подвергнутых острой алкогольной интоксикации сопровождается активацией глутатионпероксидазы, глутатионредуктазы, глутатион-S-трансферазы и гамма-глутамилтрансферазы. Активность глутатионпероксидазы 5-й группы в 1,55, а глутатионредуктазы в 1,28 раза превышает аналогичный показатель 3-й группы. Увеличение активности данных ферментов в этих условиях может быть обусловлено индукцией экспрессии данных ферментов под влиянием ARE. Активность глутатион-S-трансферазы в почках животных 5-й группы в 2,00 раза выше относительно аналогичного показателя 3-й группы. Активность гамма-глутамилтрансферазы у крыс 5-й группы оказалась выше в 1,4 раза в сравнении с аналогичным показателем 3-й группы.

Острая интоксикация этанолом на фоне чрезмерных физических нагрузок привела к более выраженным изменениям биохимических показателей. Содержание глутатиона в почках крыс 6-й группы ниже в 1,24 и 3,25 раза относительно аналогичного показателя в 4 и 5-й группах соответственно. Несмотря на то, что введение этанола крысам 5-й группы способствовало увеличению активности глутатионпероксидазы и глутатионредуктазы, у крыс 6-й группы отмечается снижение этих показателей. Активность глутатионпероксидазы в почках животных 6-й группы ниже в 1,41 и 3,24 раза относительно аналогичного показателя в 4 и 5-й группах соответственно. Активность глутатионредуктазы снизилась в 5,23 и 4,06 раза в сравнении с аналогичным показателем в 4 и 5-й группах соответственно. Объяснить это можно тем, что на момент введения этанола животным, у них уже отмечаются признаки угасания функции антиоксидантной системы, в частности ее глутатионового звена. Этиловый спирт в этих условиях только лишь усугубляет положение, внося дополнительное количество АКМ, образующихся в процессе его метаболизма. Также немаловажно то, что острая алкогольная интоксикация способствует снижению активности общих путей катаболизма [3], приводя тем самым к истощению запасов углеводов. Усиление анаэробного гликолиза также способствует интенсификации острого нарушения метаболизма пуринов.

Несмотря на снижение активности глутатионпероксидазы и глутатионредуктазы в почках крыс 6-й группы, активность глутатион-S-трансферазы и гамма-глутамилтрансферазы в них остается самой высокой в сравнении со всеми группами. Значение показателя активности глутатион-S-трансферазы у крыс 6-й группы в 1,08 и 1,16 раза выше относительно аналогичного показателя в 4 и 5-й группах соответственно. Активность гамма-глутамилтрансферазы в 1,22 и 1,92 раза выше в сравнении с аналогичным показателем в

1   и 5-й группах соответственно. Данная особенность связана с тем, что накопившиеся при чрезмерных физических нагрузках продукты перекисного окисления липидов ингибируют активность энзимов глутатионового редокс-цикла и стимулируют активность глутатион-S-трансферазы и гамма- глутамилтрансферазы. Введение крысам этанола на фоне чрезмерных физических нагрузок вызывает еще большее подавление активности первых ферментов и значительное увеличение активности вторых.

Заключение. Острая интоксикация этанолом на фоне чрезмерных физических нагрузок приводит к падению уровня глутатиона в почках крыс, снижению активности глутатионпероксидазы и глутатионредуктазы на фоне активации глутатион-S-трансферазы и гамма-глутамилтрансферазы.

 

Список литературы

 

1.       Вировец О.А. О повышенных потерях макро- и микроэлементов при занятиях спортом и целесообразности их компенсации биологически активными добавками // Вопросы питания. – 2009. – Т. 78, № 2. – С. 67–71.

2.       Власова С.Н., Шабунина Е.И., Переслегина И.А. Активность глутатионзависимых ферментов эритроцитов при хронических заболеваниях печени у детей // Лабораторное дело. – 1990. – № 8. – С. 19–21.

3.       Зезеров Е.Г. Биохимические механизмы острого и хронического действия этанола на организм человека // Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии. – 1998. – № 2. – С. 47–55.

4.       Конвай В.Д., Чигринский Е.А., Корнякова В.В., Рейс Б.А. Активность антиоксидантных ферментов эритроцитов при интенсивных физических нагрузках на фоне приема D-рибозы // Вопросы питания. – 2011. – Т. 80, № 3. – С.75–79.

5.       Корнякова В.В., Конвай В.Д., Величко Г.Н. Роль нарушения метаболизма пуринов в развитии повреждений эритроцитов, вызванных чрезмерными физическими нагрузками // Проблема сохранения здоровья в Сибири и в условиях Крайнего Севера: сборник материалов Всероссийской научно-практической конференции (Омск, 16–19 октября 2007 г.). – Омск: СибГУФК, 2007. – С. 315 – 320.

6.       Корнякова В.В., Конвай В.Д., Муратов В.А. Нарушение метаболизма пуринов в организме людей и крыс при утомлении при интенсивных физических нагрузках и прогнозирование этого состояния // Омский научный вестник. – 2015. – № 2 (144). – С. 227–230.

7.       Костромитиков Н.А., Суменков Е.А. Определение глутатиона фотоколориметрическим методом исследования // Вестник РАСХН. – 2005. – № 5. – С. 69–70.

8.       Синдирева А.В. Критерии и параметры действия микроэлементов в системе почва-растение- животное: Автореф. дис. … д-ра. биол. наук. – Тюмень, 2012. – 32 с.

9.       Синдирева А.В., Зайко О.А. Влияние селена, содержащегося в кормах, на структурные и функциональные изменения в печени // Научная жизнь. – 2012. – № 2. – С. 88.

10.    Чигринский Е.А. Антиоксидантная система семенников крыс при физических нагрузках разной интенсивности: Автореф. дис. … канд. биол. наук. – Новосибирск, 2010. – 22 с.

11.    Чигринский Е.А., Конвай В.Д., Ефременко Е.С., Соснин М.И. Активность ферментов системы глутатиона в почках крыс при чрезмерных физических нагрузках // Современные проблемы науки и образования (электронный журнал). – 2014. – № 4. URL: www.science-education.ru/118- 13884 (дата обращения: 10.10.2016).

12.    Habig W.H., Jakoby W.B. Glutathione S-transferases (rat and human) // Methods Enzymol. – 1981.Vol. 77. – P. 218–231.

13.    Nikolaidis M.G., Jamurtas A.Z., Paschalis V. The effect of muscle-damaging exercise on blood and skeletal muscle oxidative stress: magnitude and time-course considerations // Sports Med. – 2008. – Vol. 38, № 7. – P. 579–606.

14.    Persijn J.P., van der Slik W. A new method for the determination of gamma-glutamyltransferase in serum // J. Clin. Chem. Biochem. – 1976. – V. 14, N 9. – P. 421–427.