ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЗОПИКЛОНА В БИОЛОГИЧЕСКИХ ОБЪЕКТАХ ЛАБОРАТОРНЫХ ЖИВОТНЫХ

В исследовательских работах по химико-токсикологическому анализу, посвящённых разработке методов определения токсических веществ в тканях внутренних органов, принято проводить эксперименты на модельных объектах. Для этого к измельчённой ткани или крови добавляют определённое количество токсического вещества и через некоторое время проводят исследование. Однако этого недостаточно, т.к. попадающее в живой организм вещество подвергается различным превращениям: активно связывается с белками и другими эндогенными соединениями, метаболизируется, депонируется, выводится из организма и т.д. Для рекомендации в практику судебно-химических (химико-токсикологических) лабораторий методику необходимо апробировать в опытах на животных.

Разработанная нами методика на модельных образцах была применена для определения зопиклона в трупной крови и печени [1,2]. Целью настоящей работы является апробация методики в опытах на животных (крысах).

Для этого были использованы три беспородные лабораторные крысы, каждой из которых с помощью зонда в желудок вводили лекарственный препарат в виде суспензии, содержащей 15, 30, 45 мг зопиклона, соответственно. Через 1 час 50 минут крысы были умерщвлены путём эфирного наркоза. После вскрытия крыс были исследованы печень, почки, легкие, кровь (Табл.1).

Таблица 1

 Объекты исследования крыс

Методика. 5,0 г измельченной ткани печени помещали в три пенициллиновых флакона вместимостью 20 мл, добавляли 10,0 мл ацетона и экстрагировали путём тщательного встряхивания в течение 10 мин. В каждом случае ацетоновый экстракт отделяли от ткани центрифугированием при 3000 об/мин, фильтровали через небольшой ватный тампон в пенициллиновый флаконы и  процедуру экстрагирования повторяли  ещё раз с использованием 5,0 мл ацетона. Ацетоновые экстракты, полученные на каждой ступени, объединяли и выпаривали на водяной бане при 40°С и слабом потоке воздуха до удаления растворителя. К остатку во флаконе добавляли по 5,0 мл 0,1 н. раствора соляной кислоты и н-гексана, содержимое тщательно встряхивали в течение 5 мин.

После разделения фаз, водную фазу отделяли, подщелачивали раствором гидроксида аммония до рН 9 и экстрагировали 5 мл хлороформа. Хлороформный слой отделяли, выпаривали, сухой остаток растворяли в небольшом количестве хлороформа и количественно в виде полосы наносили на стартовую линию пластины Сорбфил 100х150 мм с флюоресцирующей добавкой. Хроматографирование проводили в системе ацетон параллельно со смесью пяти метчиков (кодеин, дикаин, новокаин, амидопирин, сибазон) и рабочего стандартного образца зопиклона в камере, без насыщения парами растворителя [3].

После проведения ТСХ-скрининга и рассматривания хроматограммы в УФ-свете (254 нм) обнаружено гашение флюоресценции в виде полосы темно-сиреневого цвета в III группе (полоса 2) и пятно рабочего стандартного образца зопиклона, имеющие одинаковые индексы удерживания, равные 3,04±0,07 (Рисунок 1-а). Таким образом зопиклон, выделенный из печени крысы, имеет такие же хроматографические характеристики, как стандартный образец зопиклона. Далее зону на уровне стандарта счищали в пенициллиновый флакон. После чего пластину обрабатывали реактивом Драгендорфа, для обнаружения метаболитов основного характера. В результате была обнаружена полоса оранжевого цвета в I хроматографической группе (полоса 4), предположительно метаболита зопиклона (Рисунок 1-б).

Полученные растворы спектрофотометрировали в диапазоне 200 – 400 нм (раствор сравнения – этанол). Полученные во всех трех случаях спектральные кривые (Рисунки 2, 2-4) соответствовали спектру стандартного раствора зопиклона (кривая 1).

После обработки хроматограммы реактивом Драгендорфа, зону, окрашенную в оранжевый цвет и расположенную в первой хроматогрофической группе (полоса 4), счищали в пенициллиновый флакон. Элюирование вещества в данном случае проводили путем экстракции после добавления во флакон по 5 мл 0,1 н. раствора гидроксида натрия и хлороформа. Хлороформный экстракт отделяли путем центрифугирования, фильтровали через сухой бумажный фильтр в присутствии безводного сульфата натрия и выпаривали досуха при 40о С на водяной бане под слабым током воздуха. Сухой остаток растворяли в 5 мл спирта и раствор спектрофотометрировали в условиях, описанных выше. Полученная спектральная кривая 5 может быть отнесена к спектру предполагаемого метаболита зопиклона или примесного соединения.

Количественное определение зопиклона, выделенного из биологических объектов, проводили по стандарту. Оптическая плотность спиртового раствора зопиклона, содержащего 15 мкг/мл, измеренная при 305 нм, равна 0,588. Данные экспериментов приведены в Табл.2.

Таблица 2

 Результаты определения зопиклона в биологических объектах крыс

Примечание: 1,2,3 - сухие остатки растворяли соответственно в 10, 15 и 30 мл спирта.

Таким образом, результаты выполненных экспериментов показали, что описанная методика экстракционного выделения, идентификации и количественного определения зопиклона применима для анализа посмертных образцов лабораторных животных.

Список литературы

1.     Чепурная Г.П. Определение Z-препаратов в  трупной крови//Разработка и регистрация лекарственных средств. – 2015. - № 4.- С. 60-62.

2.     Карташов В.А., Чепурная Г.П., Чернова Л.В. Определение зопиклона в ткани печени. Determination of Zopiclone in liver tissue. Proceedings of the 5th European Conference on Biology and Medical Sciences (March 28, 2015). «East West» Association for Advanced Studies and Higher Education GmbH. Vienna.-2015. P. 112- 117.

3.     Карташов  В.А.,  Чернова  Л.В.  Химико-токсикологический  анализ.  Ч.  2:  Методы  исследования. Тонкослойная хроматография. – Майкоп: Качество, 2011. – 92 с.