ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА ХРОНИЧЕСКИХ ДЕРМАТОЗОВ

Атопический дерматит (АтД) – генетически обусловленное, хроническое, рецидивирующее заболевание кожи, клинически проявляющееся первично возникающим зудом, воспалением, лихеноидными папулами и лихенификацией [1]. АтД – одно из самых распространенных воспалительных заболеваний кожи; распространенность этого дерматоза среди населения разных стран составляет не менее 5–10%, в индустриально развитых государствах – около 20%, а у детей АтД занимает лидирующее положение в структуре всех аллергических проявлений, сопровождающих детский возраст [2]. Для АтД характерно многообразие клинических проявлений, в основном зависящих от возраста, определяющего стадийность развития болезни. Диагностика АтД основывается преимущественно на клинических данных; объективных диагностических тестов, позволяющих подтвердить диагноз, в настоящее время не существует. Поэтому поиск новых диагностических маркеров у пациентов с АтД является актуальной задачей.

Мембранные нарушения определяют патологическое единство многих процессов [3,4]. Перенос ионов через клеточную мембрану с помощью переносчиков белковой структуры, включающий активный транспорт и облегченную диффузию, является неотъемлемой частью жизнедеятельности всех клеток организма человека в норме и при патологии [5]. Одной из ион-транспортных систем является натрий-литиевый противотранспорт (НЛПТ) через мембрану эритроцита. Предполагается, что данная ион-транспортная система является чувствительным индикатором функционирования клеточных мембран, изменения состояния которых, в свою очередь, может инициировать патологию или, напротив, быть обусловленным патологическим процессом [6,7].

Цель исследования. Оценка скорости Na+-Li+- противотранспорта в мембране эритроцита у детей с АтД и его диагностическая значимость.

Материалы и методы.

В исследовании принимали участие 95 детей. Из них 70 детей больных АтД и 25 детей составили контрольную группу. Скорость Na+-Li+-ПТ оценивали по методу М. Canessa. Исследование проводилось в лаборатории клеточных мембран кафедры пропедевтики внутренних болезней КГМУ (зав. кафедрой проф. В.Н. Ослопов).

Забор и транспортировка крови. Кровь в количестве 3 мл забирали утром из вены в смоченные гепарином (20 ЕД на 1 мл крови) пластиковые пробирки, содержимое перемешивали и пробирки немедленно помещали в контейнер с тающим льдом. Исследование начинали сразу после транспортировки крови с завода в лабораторию клеточных мембран кафедры пропедевтики внутренних болезней Казанского государственного медицинского университета (заведующий кафедрой – академик АИ РТ, профессор В.Н. Ослопов).

Ход определения.

1.     Отделение эритроцитов. Эритроциты осаждали на рефрижераторной центрифуге с вертикальным ротором при 0-2°С при достижении 3000g в течение 5 минут (фото 16).

Число оборотов центрифугирования (п) при заданной g рассчитывали по формуле:

Плазму и лейкоциты удаляли путем отсасывания.

1.          Промывание эритроцитов. Эритроциты дважды промывали трехкратным объемом холодной (температура тающего льда) среды А (cереда промывки) следующего состава (мМ): 75 – MgCl2; 85 – сахароза, 10

– глюкоза; 10 – HEPES-трис (рН 7,4) при тех же условиях осаждения (фото 17, 18, 19, 20).

2.          Прединкубация - нагрузка эритроцитов литием. 0,25 мл упакованных эритроцитов помещали в 1,25 мл среды Г следующего состава (мМ): 150 – LiCl; 10 – глюкоза; 10 – HEPES-tris (pH 7,4) при 37° С и прединкубировали 3 часа при той же температуре с периодическим встряхиванием (автоматическое шейкирование каждые 15 минут по 15 секунд) (фото 21, 22).

3.          Промывание эритроцитов. Суспензию осаждали и эритроциты промывали (для удаления наружнего лития) 4 раза 4-х кратным объемом среды А при 0-2°С.

4.          Инкубация (ключевая часть исследования). В этот период происходит выход лития в натриевую и безнатриевую (магниевую) среды за счет обмена лития на натрий и магний, осуществляемого благодаря работе белка-переносчика в условиях ингибирования Na+ -К+ -АТФазы уабаином (фото 22).

Упакованные эритроциты (по 0,1 мл) переносили в среду Б (1 мл) и в среду В (1 мл).

Среда Б является средой, свободной от натрия. Фактически это среда А (среда промывки), содержащая изоосмотическую смесь MgCl2 и сахарозы, но с добавлением 0,1 мМ уабаина. В этом случае она получает название среды Б. Среда В – это среда, напротив, богатая натрием, содержащая (мМ): 150 – NaCl; 10 – глюкоза; 10 – HEPES-трис (рН 7,4); 0,1 – уабаин.

Инкубация продолжалась 60 минут при температуре 37°С с периодическим встряхиванием.

5.           Отбор супернатанта. На 60-й минуте инкубации отбирали 0,45 мл суспензии эритроцитов из обеих сред, производили центрифугирование при указанных выше (пункт 1) условиях в течение 2 минут, а затем надосадочную жидкость (супернатант) в количестве 0,3 мл осторожно отбирали и разбавляли в 3 раза тридистилированной водой.

6.           Определение концентрации лития. Измерение содержания лития в средах Б и В (магниевой и натриевой) проводили методом атомной абсорбционной спектрофотометрии в режиме эмиссии на спектрофото- метре СА-455 (ПО КОМЗ, г.Казань).

7.           Вычисление конечного результата – максимальной скорости Na+-Li+-ПТ в мембране эритроцита.

Максимальная скорость Na+-Li+-ПТ (V) в микромолях Li на 1 литр клеток в час определялась как разность между концентрациями лития в среде, богатой натрием (АNa), и в среде, свободной от натрия (AМg), через 60 минут инкубации по формуле:

Результаты и обсуждение.

V = (A Na – AМg) × К, где К (коэффициент) = 33

Для каждого члена групп были проведены измерения скорости Na+-Li+-ПТ в мембранах эритроцитов. Средняя величина скорости в группе детей с атопическим дерматитом составила 299,7±6,1 мкмоль Li/л кл./час. Более низкое среднее значение данного показателя обнаружено у здоровых детей, т.е. в той группе, которая по всем клинико-анамнестическим и лабораторным показателям была принята нами за норму – 212,9±10,9 мкмоль Li/л кл./час. Максимальные средние величины Na+-Li+-ПТ, выявленные у детей, больных АтД, возможно, отражают повышение проницаемости клеточной мембраны для ионов за счет активации перекисных процессов и дисбаланса между α и β-адреноре-цепторами (блокада β -рецепторов и преобладание α -рецепторов), т.е. изменения данного параметра являются следствием течения воспалительного процесса. В то же время не исключено, что повышенная проницаемость мембраны и есть тот неблагоприятный фон, на котором развивается в дальнейшем АтД. При сравнении средних величин скорости Na+-Li+-ПТ в мембранах эритроцитов сравниваемых групп параметрическими методами выявлены достоверные различия (р <0,05; Т>2). Как и в ряде опубликованных работ, так и в нашем исследовании отмечены черты мультимодальности гистограммы распределения скорости Na+-Li+-ПТ у детей сравниваемых групп. Если графически представлять реальную дисперсию индивидуальных величин скорости Na+-Li+-ПТ здоровых и больных детей, то обнаруживается достаточно большая область

«перехлеста», зоны захождения сравниваемых ареалов. При этом на основе сопоставления значений скорости у контрольной группы здоровых пациентов и у детей больных АтД установлено, что у 78% членов контрольной группы указанная скорость была ниже порогового значения в 258 мкмоль Li/л кл./час, а у 91% членов испытуемой группы в зависимости от тяжести заболевания она была выше. Таким образом, данный пограничный показатель скорости Na+-Li+-ПТ в 258 мкмоль Li/л кл./час и значения его превышающие позволяют с высокой точностью выделять лиц с АтД.

Выводы.

Проведенное исследование позволяет утверждать, что определение уровня скорости Na+-Li+-ПТ может быть использовано в качестве диагностического критерия АтД у детей и позволяет выявить важную информацию, которая не может быть получена при физикальном, лабораторном и инструментальном исследовании. По результатам исследования получены патенты на изобретение: № 2459210 «Способ диагностики атопического дерматита у детей» и № 2521400 «Способ диагностики атопического дерматита у детей».

Список литературы

1.     Атопический дерматит: Руководство для врачей. / Под ред. Ю.В. Сергеева. – М.: Медицина для всех, 2002. – 183 С.

2.     Атопический дерматит: От патогенеза к  диагностике. / Сергеев А.Ю., Сергеев Ю.В., Караулов А.В., Кудрявцева Е.В. / Практическая пульмонология. 2003. № 4. С. 35-39.

3.     Постнов Ю.В. К развитию мембранной концепции патогенеза первичной гипертензии (нарушенная функция митохондрий и энергетический дефицит) / Ю.В. Постнов // Кардиология. – 2000. – №10. – С. 4-12.

4.     Бутусова В.Н. Структурно-функциональные свойства клеточных мембран при дислипопротеидемиях: автореф. дис. … канд. мед. наук / В.Н. Бутусова. – Новосибирск, 2007. – 24 с.

5.     Ахметвалеева Ю.Н. Характеристика  структурно-функциональных свойств клеточных мембран при воспалительных поражениях бронхов у детей и их метаболическая коррекция: дис. … канд. мед. наук / Ю.Н. Ахметвалеева. – Казань, 2007. – 118 с.