19 ноября 2016г.
Даже беглый просмотр современных отечественных иммунологических журналов показывает, что результаты исследований клеточных факторов иммунитета выражаются авторами тремя способами: как относительные значения (проценты), как абсолютные значения (число клеток в микролитре или в пересчете на 1 литр) и как сочетание относительных и абсолютных значений.
Целью настоящей работы являлся анализ частоты использования отмеченных типов учета показателей клеточного иммунитета в отечественных публикациях в области клинической иммунологии.
Методы исследования
Дизайн исследования – наукометрическое (библиометрическое) ретроспективное исследование. Использовались публикации журналов «Иммунология», «Российский иммунологический журнал» и «Медицинская иммунология» за 2012-205 гг., а также журнал «Иммунология» за 1981-1985 гг. Применялся «ручной поиск» (hand search) в полиграфических версиях журналов. Объем информационной базы уточнялся после получения данных об относительной частоте изучаемых признаков.
Критерии включения. В анализ включались только структурированные научные статьи (статьи, краткие сообщения и публикации Всероссийского иммунологического форума на Урале). В качестве контент-критерия использовалась принадлежность статьи к объекту исследования «человек». Включались публикации, проводившие проточный цитометрический анализ, а также публикации, авторы которых использовали метод непрямой иммунофлюоресценции (ИФ) или (в работах 1981-1985 гг.) метод розеткообразования. Включены также исследования по фенотипированию интратуморальных лимфоцитов и тканевых лифоцитов, поскольку в этих случаях возможно не только получение клеточной взвести для анализа, но и перевод полученных относительных данных в абсолютные путем перерасчета на единицу массы анализируемой ткани.
Исключались статьи, чьи выводы основывались на исследованиях in vitro либо непосредственный анализ в небольшом по объему биопсийном материале методом ИФ, что исключало расчет содержания определенного числа клеток на единицу массы материала.
За период 2012-2015 гг. из 653 работ на человеческом материале в анализ было включено 183 статьи, посвященные иммунофенотипированию клеток, а в период 1981- 1985 гг. из 155 работ на человеческом материале в анализ было включено 44 статьи, определявшие содержание Т- и В-лимфоцитов.
Статистический анализ полученных данных проводился с использованием скорректированного критерия Хи-квадрат (в том числе и для тенденции) с помощью программы «Statсalc», а ее подпрограмма «Population survey» применялась для уточнение необходимого объема исследования (свободно распространяемый комплекс программ для эпидемиологов «Epi Info», версия 7.2.0.1, 2016 г). Для расчета 95 % доверительного интервала для отношений использовалась свободно распространяемая программа «Winpepi» (версия 11.5, 2015 г) [6].
Этические аспекты. Авторы разделяют и поддерживают точку зрения журнала «Экология человека», высказанную в публикации, посвященной анализу ошибок в статистической обработке данных – мы знакомим «…будущих авторов с наиболее часто встречающимися ошибками, а не с авторами, которые эти ошибки допускают» [1, c. 55], поэтому ссылки на отдельные публикации намеренно не приводятся. Во всех остальных случаях использования литературных источников авторы заявляют, что не имеет никаких личных мотивов.
Результаты
В период 1981-1985 гг. относительная частота оценки показателей клеточного иммунитета в абсолютных цифрах составляла 18 %. Используя программу «Population survey» и принимая нижнюю границу доверительного интервала для абсолютных оценок (8 %) как минимально приемлемую и размер выборки в 155 статей на человеческом материале за размер исследуемой популяции, получаем, что для оценки данного показателя с ошибкой в 0,1 % было бы необходимо проанализировать 96 статей на человеческом материале. Расчет для более часто встречавшихся статей, использовавших только процентные оценки (34 %), показывает необходимый размер выборки для оценки с ошибкой в 0,1 % в 44 статьи.
Аналогичные расчеты для выборки за 2012-2015 гг. (653 статьи на человеческом материале) показывают, что для оценки относительной частоты работ, использовавших только абсолютные значения с ошибкой в 0,1 %, было бы необходимо проанализировать 458 статей, а для оценки относительной частоты работ, использовавших только процентные оценки – 27 публикаций на человеческом материале.
Таким образом, мы считаем размер использованных нами выборок журнальных статей репрезентативным, так что результаты статистического анализа полученных данных не могут быть смещенными из-за недостаточного объема анализируемых выборок.
Частоты использования только относительных оценок, их сочетания с абсолютными и только абсолютных оценок в журналах «Иммунология», «Медицинская иммунология» и «Российский иммунологический журнал» в период 2012-2015 гг. статистически значимо не различались. Также не было выявлено линейного тренда в частотах использования этих трех типов оценок для каждого из анализируемых журналов. С одной стороны, это показывает, что сложившиеся стереотипы в оценке содержания клеток иммунной системы (в процентах, в абсолютных цифрах или в их сочетании) сформировались раньше, до 2012 г., с другой стороны, — позволяет дать обобщенную оценку изучаемым показателям. В период 2012-2015 гг. в журналах «Иммунология», «Медицинская иммунология»,
«Российский иммунологический журнал» относительная частота статей, использовавших для оценки клеток иммунной системы только проценты, составила 0,47 (0,39 – 0,54), относительная частота статей, использовавших как проценты, так и абсолютные значения составила 0,45 (0,38 – 0,53), а относительная частота публикаций, опиравшихся только на абсолютные значения – 0,076 (0,042 – 0,12).
Упомянутые журналы, очевидно, можно отнести к российским «коровым» иммунологическим журналам, в них публикуются члены разнообразных российских научных иммунологических обществ и поэтому выявленные тенденции для данных журналов, характерны для российской иммунологии в целом.
Журнал «Иммунология», созданный в 1980 г, был первым специализированным советским журналом для иммунологов, поэтому выборка публикаций из этого журнала за 1981-1985 гг. представляется характерной для всего иммунологического сообщества СССР. В этот период советские иммунологи использовали для оценки субпопуляционного состава лимфоцитов периферической крови процентные оценки с относительной частотой 0,34 (0,2 – 0,49), сочетание процентных оценок с абсолютными значениями с относительной частотой 0,48 (0,32 – 0,63) и только абсолютные оценки с относительной частотой 0,18 (0,082 – 0,33).
По критерию Хи-квадрат сравнение частот данных за «советский» период и за период 2012-2015 гг. не показывает статистически значимых различий: для процентных оценок c2 = 1,89, р = 0,17; для сочетания процентных и абсолютных оценок c2 = 0,013, р = 0,91 и для оценок только в абсолютных цифрах – c2 = 3,37, р = 0,07. Принимая критическое значения уровня доверительной вероятности как меньшее или равное 0,05, нельзя говорить о статистически значимых отличиях в сравниваемых показателях за два периода, разделенных промежутком в 25 лет. В силу этого возможно объединение данных для изучаемых периодов: при определении содержания клеток иммунной системы в публикациях отечественных авторов относительные частоты только процентных оценок составляют 0,44 (0,38 – 0,51), сочетания процентных оценок с абсолютными значениями – 0,46 (0,39 – 0,52), только абсолютные оценки – 0,097 (0,063 – 0,14).
На взгляд авторов, правомерность подобного объединения подтверждается также сравнением полученных данных с «отдельно взятым годом (2005 г.)» в «отдельно взятом журнале» («Медицинская иммунология») как опровержение маловероятного допущения, что в 80-х гг. прошлого века все было плохо, и сейчас все плохо, а вот в середине этого периода было хорошо. В 2005 г. «Медицинская иммунология» опубликовала статьи с процентной оценкой с относительной частотой 0,57 (0,34 – 0,78), что значимо не отличается от значений обобщенной выборки (c2 = 0,078, р = 0,38); статьи, использовавшие проценты и абсолютные оценки с относительной частотой 0,38 (0,18 – 0,61), что не отличается от значений обобщенной выборки (c2 = 0,203, р = 0,65); статьи, использовавшие только абсолютные оценки было 0,05 (0,001 – 0,24), что также статистически значимо не отличается от обобщенных данных (c2 = 0,12, р = 0,73).
Обсуждение
Оценка лейкограммы в процентах в контексте образовательных программ высшего медицинского образования обычно называлась «студенческой ошибкой». Если в 80-х гг. прошлого века иммунологи расширили лимфоцитарное звено до 2-х субпопуляций, а в настоящее время число определяемых субпопуляций лимфоцитов зачастую превышает добрый десяток, то это не значит, что не перестали действовать основополагающие принципы клинической лабораторной диагностики и можно оперировать только процентными значениями.
Автор фундаментального руководства по клинической лабораторной диагностике, болгарский профессор Й. Тодоров в шестом (!) русском издании своего труда пытается убедить врачей в необходимости только абсолютных оценок, приводя элементарные расчеты, показывающие, что 30 % от 6000 лейкоцитов в мм3 (1800 клеток/мкл) – это одно значение, а 30 % от 20000 лейкоцитов (6000 клеток/мкл) – это совсем другое значение. Й. Тодоров заключает, «…данные дифференциальной формулы всегда должны оцениваться в связи с общим числом лейкоцитов, принимая во внимание, что важны только абсолютные величины. Лучше всего было бы отказаться от принятых теперь в гематологии процентных обозначений и, после определения дифференциальной формулы, сейчас же вычислять абсолютные величины каждого вида клеток» [4, с. 412]. Конечно, подобные взгляды высказывались и раньше, и позже, но отечественной клинической иммунологии они не затронули.
Очевидно, никакого влияния на основную массу отечественных иммунологов не оказало и свободно распространяемое в сети Интернет последнее издание фундаментального «Руководства по иммунологии человека», предостерегающее от использования относительных оценок содержания клеток иммунной системы, которые могут не изменяться при серьезных отклонениях общего числа лейкоцитов [7].
Очевидно, что свет истины для отечественного иммунологического сообщества должны были привнести вышедшие в 1984 г первые и единственные в СССР и России методические рекомендации «Оценка иммунного статуса человека» [3]. Там отмечалось, что определение только Т- и В-лимфоцитов относится к наиболее общим тестам, тестам первого уровня, а надо стремиться к тестам второго уровня, использующим моноклональные антитела для более детального выявления субпопуляций лимфоцитов человека. В отношении же тестов первого уровня были приведены повозрастные графики содержания процентного и абсолютного содержания Т- и В-клеток, в узловых точках показаны планки дисперсии в виде удвоенных среднеквадратичных отклонений. Объем выборки, на которой получены нормативные значения, не указан.
В рекомендуемой «Карте первичного обследования иммунного статуса» сначала надо было привести число лейкоцитов и лейкоцитарную формулу крови (в %), а затем абсолютное число лимфоцитов, относительное и абсолютное число Т- и В-лимфоцитов.
Какие из значений — относительные или абсолютные необходимо использовать в медицинской практике — указано не было [3].
В 1989 г в Новосибирске вышла в свет методическая разработка «Нормативы иммунного статуса населения Сибири и крайнего Севера», обусловленная, очевидно, необходимостью оправдать многолетние исследования предполагаемых отличий иммунного статуса у жителей Новосибирска, Норильска или Магадана [2]. Доказательства приводились в процентах.
В 2009 г выходит в свет издание «Аллергология и иммунология: национальное руководство» [5], адресованное аллергологам и иммунологам, терапевтам, педиатрам, студентам старших курсов медицинских вузов, интернам, ординаторам, аспирантам. Цель издания данного руководства — обеспечение указанных категорий читателей современной информацией, «необходимой для непрерывного медицинского образования» [5, с.10]. В 2012 г выходит «карманная» версия данного издания. Однако это всего лишь учебное пособие, подготовленное московскими специалистами, а не клиническое руководство, призванное дать читателям доказанные выводы всего мирового опыта по вопросам иммунологии и аллергологии. В отношении интерпретации данных о содержании клеток иммунной системы в периферической крови, приведенных в виде нормативов как в виде процентов, так и в виде абсолютных значений, в данных «Национальных рекомендациях» не указано, какими из них практической врач должен руководствоваться в своей практике.
Если использование только процентных значений содержания клеток иммунной системы в крови и других объектах – грубая ошибка, то ничуть не лучше по своим последствиям использование авторами публикаций сочетания процентных и абсолютных значений. Дело в том, что и в 80-е годы прошлого века и в настоящее время авторы таких работ рассматривали ряды процентных и абсолютных данных как независимые переменные и в силу своих представлений об анализе независимых переменных такой анализ проводили. С одной стороны, это увеличивало ореол наукообразности таких работ, но с другой – несло в себе реальную опасность для пациентов практических врачей, если они решат использовать в своей работе данные таких исследований. При этом авторы таких работ сознательно или бессознательно придерживались того принципа, что если сравнение двух переменных не показывает «достоверных» отличий (р > 0,05), то такие данные публиковать не стоит. Однако, если получены данные об относительном снижении какой-либо субпопуляции лимфцитов при нормальном содержании абсолютного числа таких клеток, то в выводы, конечно же, входило заключение о снижении содержания данной субпопуляции у больных с изучаемым заболеванием. Будут наукообразно обсуждаться различия в величине коэффициента корреляции между относительным содержании клеток Х и цитокина Y и абсолютным содержанием клеток X и цитокина Y и т.п.
В настоящее время большинство исследований субпопуляционного состава клеток иммунной системы проводится методом проточной цитометрии – в выборке 2012-2015 гг. таких работ было 92 %. В 1981-1985 гг. проведение таких исследований было невозможно. В настоящее время цитометрический анализ доступен не только в крупных академических центрах, но и во многих областных и краевых столицах. При этом можно считать, что процентные оценки как «студенческая ошибка» значительно повысили свой статус уже до «академической ошибки».
Применение авторами статей в международных журналах в 80-х гг. XX века моноклональных антител и проточной цитометрии отечественным иммунологам представлялось верхом технического прогресса, которого советские исследователи были лишены. В настоящее же время в России это уже чуть ли не рутинный метод исследования. Данный факт следует расценивать как серьезное достижение организаторов российской науки и здравоохранения. Однако нельзя мириться с фактом превращения бюджетных средств (или, как раньше говорили, «народных» средств) в информационный мусор. Количественные наукометрические показатели (кто кого сколько раз цитировал и т.п.) ничего не говорят о качестве опубликованных работ: совершенно необходимы хотя бы простейшие квалиметрические методы.
Заключение
1. В период 1981-2015 гг. отечественная клиническая иммунология в отношении исследований содержания клеток иммунной системы в 6 – 14 % опубликованных работ использовала абсолютные оценки содержания клеток, что являлось необходимой базой для адекватной интерпретации и формирования верных выводов в данных исследованиях.
2. В период 1981-2015 гг. отечественная клиническая иммунология в отношении исследований содержания клеток иммунной системы в 94 – 99 % публиковала статьи с сомнительными выводами, что было обусловлено использованием либо только процентных значений, либо их произвольным сочетанием с абсолютными.
Конфликт интересов
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Финансирование
* Настоящее исследование поддержано грантом Российского гуманитарного научного фонда (проект № 16-03-00345).
Список литературы
1. Гржибовский А. М. Использование статистики в российской биомедицинской литературе // Экология человека. 2008; 12: 55-64.
2. Нормативы иммунного статуса населения Сибири и крайнего Севера.Методическая разработка. / Составители Е. Л. Гельфгат, В. И. Коненков, А. В. Крайнов, М. Ю. Тузов. Новосибирск, 1989.
3. Оценка иммунного статуса человека. Методические рекомендации /Составители: Р.В. Петров, Ю. М. Лопухин, А. Н. Чередеев, Л. В. Коваль- чук, К. А. Лебедев М.: МЗ СССР, 1984.
4. Тодоров Й. Клинические лабораторные исследования в педиатрии. София: Медицина и физкультура; 1968.
5. Хаитов Р. М., Ильина Н. И., ред. Аллергология и иммунология: национальное руководство. М.: ГЭОТАР-Медиа, 2009.
6. Abramson J. H. WINPEPI updated: computer programs for epidemiologists, and their teaching potential // Epidemiol Perspect Innov. 2011; 8(1):1. doi: 10.1186/1742-5573- 8-1.
7. Maurice R., O’Gorman G., Donnenberg A. D., ed. Handbook of human immunology. 2nd ed. CRC Press, Taylor & Francis Group, Boca Raton, London, New York, 2008.
