ФИЗИОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ СЛУХА У МЫШЕЙ

Слух - филогенетически один из наиболее древних органов чувств. Основываясь на современной теории развития слухового анализатора, считается, что он является превалирующим органом чувств у млекопитающих. Ухо млекопитающих имеет сложную многоуровневую четкую уникальную структуру. Среди всех млекопитающих именно у человека оно несет особую функцию, играет важную роль в формировании речи и позволяет стать ему социально активным. Изучение физиологии и патологии слуха ведется с давних времен, но до сих пор при современных возможностях слух остается до конца не изученным. Маленькие размеры улитки, ее расположение в толще височной кости, целостность органа и в целом субъективность слуха являются анатомическими и физиологическими предпосылками для затруднений изучения слуха и диагностики патологии внутреннего уха. Так, наиболее достоверные методики исследования, такие как эндоскопия, биопсия и гистологическое исследование неприемлемы для исследования внутреннего уха человека. На настоящий момент существуют специализированные методики исследования слуха, которые позволяют объективизировать слуховую функцию исследуемого и опосредованно изучать различные части слухового анализатора. К ним относится рефлексометрия, отоакустическая эмиссия (ОАЭ) и слуховые вызванные потенциалы (СВП)[2]. Экспериментальное исследование позволяет объединить две группы методов исследования, визуальные, включая гистологические, и функциональные. В качестве экспериментальных животных используются различные виды грызунов. Чаще всего морские свинки, крысы и мыши. При сравнительном исследовании морских свинок, крыс и мышей в качестве моделей нейросенсорной тугоухости преимущество отдавалась морским свинкам, за их восприимчивость к ототоксическому эффекту[11,18]. Но по мере изучения патологии внутреннего уха все больше причин снижения слуха находятся среди генетических факторов [6,9,10,16,17]. В этом аспекте использование в качестве экспериментальных животных мышей открывает новые возможности для дальнейшего изучения генных факторов, молекулярных механизмов уже на трансгенных мышах, которые наиболее распространены среди всех трансгенных животных. При сравнении анатомических характеристик улитка мышей — близка к улитке человека[19]. Она имеет 2,5 завитка вокруг модиолиса, длинной около 5-6 мм [20].Частотный диапазон восприятия звуков у мышей значительно шире и составляет от 0,5 до 120 кГц. Частотный диапазон наилучшего восприятия располагается в пределах 12-24кГц[5]. Среди всех линейных мышей для экспериментальных исследований наиболее часто используются животные линии BALB/C, в том числе и для изучения слуховой функции[21].Так в период с 1993 по 1997 год на сервере Medline было зафиксировано свыше 12000 ссылок на эту линию BALB/C[21].
Но для изучения патологии слуха в эксперименте сначала необходимо изучить физиологию слуховой функции у мышей выбранной чистой линии с помощью объективных методик, таких как ОАЭ и СВП. Анализ показателей этих двух методов позволит составить целостную картинку о физиологии слуха мыши.
ОАЭ позволяет оценить функциональность микроструктур внутреннего уха, в частности микромеханику наружных волосковых клеток. Выделяют спонтанную ОАЭ, задержанную ОАЭ (ЗВОАЭ), Стимул-частотную ОАЕ (СЧОАЭ), ОАЕ на частоте продукта искажения (ПИОАЭ)[13]. Наиболее часто в клинических исследованиях используется ПИОАЭ. Ее критерии достаточно постоянны у мужчин и у женщин при равнозначных порогах слуха[1]. Достоверность ответа при повторном исследовании у людей составляет около 5-9 дБ[1,12]. Стабильность метода ПИОАЭ зарекомендовали его и для экспериментальной работы. Однако в ходе исследований было выявлено, что амплитуда ответа ПИОАЭ несколько различна у разных линий экспериментальных мышей и сильно зависит от возраста животных. И наиболее высокая амплитуда ответа ПИОАЭ у мышей линии BALB наблюдается в возрасте 2-6 месяцев[7].
СВП – единственный доступный метод, позволяющий объективно оценить уровень слуха, что делает его незаменимым при работе с животными. Среди всего многообразия СВП, чаще всего в клинической практике используют коротколатентные СВП (КСВП) или ABR в англоязычной литературе и электрокохлеографию. В случае экспериментальных работ с животными с использованием СВП при сравнении КСВП, экстратимпанальной и транстимпанальной электрокохлеографии, было установлено, что именно КСВП наиболее оптимальный метод по простоте диагностики и точности[14]. У людей при регистрации КСВП характерно появление 5 последовательных пиков, которые оцениваются по времени появления (латентности) и амплитуде. По данным последних исследований I пик характеризует активность дистальной части слухового нерва, II - состояние слухового нерва после его выхода из внутреннего слухового прохода, остальные пики — суммарную активность нейронов слухового анализатора различной локализации[3,4]. Каждый пик регистрируется в определенном временном интервале. Наиболее выраженным и стабильным считается V пик, который и является основным ориентиром при анализе исследования. Первые очертания V пика появляются при околопороговых стимулах.
КСВП мышей имеет явно другие характеристики нормы по сравнению с людьми, причем каждая линия животных может так же иметь свои особенности. КСВП у мышей имеет 4 или 5 пиков, которые возникают во временном периоде до 5-7мс по данным разных авторов[8,15,22]. Пороги слуха варьируют у разных линий и возраста животных и в среднем пики КСВП возникают при интенсивности подаваемого стимула в 33-46 дБ[22]. Однако критерии оценки КСВП у мышей, такие как количество пиков, их амплитуда, латентность, межпиковые интервалы, а также пороги возникновения подробно не изучены.
Целью нашей работы стало изучение физиологических норм при использовании методов ПИОАЭ и КСВП у мышей широко распространенной линии BALB/C, выявление взаимосвязи между амплитудой ответа ПИОАЭ и порогами слуха при использовании КСВП.
Материалы и методы
Эксперимент проводили на 10 мышах-самцах линии Balb/c весом 21-26 г, в возрасте 6-7мес. Во время регистрации ПИОАЭ и КСВП животные находились под наркозом. В качестве общей анестезии использовали комбинации препаратов золетил в дозировке 4- 8 мг/100г в/м и ксила в дозировке2-4 мг/кг в/м. Проводили исследование слуха методом ОАЭ на приборе для регистрации ПИОАЭ ILO 88/92 (Otodinamics ltd, Великобритания) и КСВП - на электромиографе Viking Quest (США). Для регистрации ПИОАЭ использовали два тональных посыла с частотами f1 и f2, в соотношении 2f1-f2. При исследовании КСВП места под электроды тщательно выбривались, протирались спиртом, для улучшения контакта. Положительный электрод располагался на вертексе, отрицательный - в заушной области и заземляющий электрод устанавливался в области основания хвоста. Стимуляцию проводили короткими широкополосными акустическими щелчками интенсивностью с 90 дБ до 10 дБ с интервалом в 10 дБ. Оценивали результат после 1000 усреднений.
Результаты исследования ОАЭ
При регистрации ПИОАЭ соотношение сигнал/шум превышал 4 дБ у 9 из 10 обследованных мышей. На основании чего одна мышь была исключена нами из исследования. DP грамма преимущественно (в 61% случаев) имела восходящую форму, с максимальной амплитудой ответа на частоте 4кГц. У 39% исследуемых ушей была получена горизонтальная форма кривой. Среднее значение соотношения сигнал/шум по частоте у мышей под наркозом представлено на Рисунке 1.



Рис.1. Средние значения ПИОАЭ у мышей (18 ушей) под наркозом.

График представлен восходящей кривой с минимальным значением на частоте 818 Гц и максимальным на частоте 7126Гц.
Результаты исследования КСВП
Структура КСВП состоит из комплекса положительных пиков. При стимуляции высокой интенсивности 80-90 дБ регистрируется 5-6 пиков. Дифференцируя волны КСВП мышей, мы основывались на стандартной картине пиков человека и КСВП мышей, описанной в литературе[17,18,19]. I волна регистрируется в 100% случаев, возникает на 1,8мс±0,29 и имеет максимально высокую амплитуду и стабильную форму. Комплекс II и III волны можно дифференцировать в 85% случаев, и они имеют не постоянную форму и возникает на 2-3мс. IV, V волны регистрируются у 70% исследуемых животных, четко дифференцируются при высокой интенсивности стимула, но при более низких - их конфигурация несколько смазана. По сравнению с V пиком у людей, V пик у мышей по нашим данным не обладает такой же стабильностью и высокой амплитудой. При снижении интенсивности наиболее стабильным и ярко выраженным пиком становится I волна, которая дифференцируется наиболее четко по сравнению с другими волнами. Следует отметить увеличение амплитуды пиков, особенно 1 и 3, по отношению к волнам человека (см. Рисунок 2).



Рис.2. КСВП взрослого человека справа и мыши слева.

При регистрации КСВП у мышей были определены средние значения латентности и межпиковых интервалов. И для сравнения представлены стандартные значения КСВП человека, используемые в ежедневной практике (см. Табл.1.)

                                                                                                                            Таблица 1

Среднее значение латентности волн у мышей (18 ушей) и взрослых.

Таким образом, латентные периоды волн мышей соотносимы с таковыми у взрослых людей, несмотря на изменение формы кривой.
При оценке порогов слышимости методом КСВП у мышей было выявлено появление первых пиков при интенсивности, в среднем, 25±8,6 дБ. Наиболее четко среди пиков пороговой интенсивности и чаще всего очерчивался именно I пик, V - несколько реже. Общеизвестно, что электрофизиологические методы у людей при нормальном слухе завышают порог слышимости примерно на 10-20дБ. Сравнивая полученные данные можно предположить, что пороги слуха мышей соответствуют порогам слуха человека.
Таким образом, проведенное исследование позволило сделать следующие выводы:
1. На основании зарегистрированных значений ПИОАЭ и КСВП изучены физиологические показатели слуха мышей, которые могут быть использованы моделирования различных патологических состояний
2. DP-грамма мышей линии BALB/C имеет максимальную амплитуду 16,56 дБ (в 61% случаев) на частоте 4125Гц.
3. Регистрация ответа ПИОАЭ на всем частотном диапазоне соответствует нормальным показателям слуховой функции при регистрации КСВП.
4. Волны КСВП у мышей имеют большую амплитуду, чем пики человека, но соответствующие значения латентности и межпиковых интервалов. Наиболее стабильно определяется I волна (в 100% случаев).
5. По данным КСВП среднее значение слуховой функции мышей линии BALB/C в возрасте 6-7мес. составляет 25±8,6 дБ.

Список литературы

1. Пальчун В.Т., Левина Ю.В., Мельников О.А. Отоакустическая эмиссия: исследование нормы. Вестник оториноларингологии 1999; 1: 5-9.
2. Петровская А.Н., Кунельская Н.Л., Кулагина М.И. Объективная оценка слуха у новорожденных детей методом регистрации стволомозговых вызванных потенциалов. Вестник оториноларингологии 2008; 3: 8- 10.
3. Таварткиладзе Г.А. Избранные лекции по клинической аудиологии. Часть 1. Москва РМАПО 2011: С. 138.
4. Buran B.N., Strenzke N., Neef A., Gundelfinger E.D., Moser T., Liberman M.C. Onset coding is degraded in auditory nerve fibers from mutant mice lacking synaptic ribbons. J Neurosci. 2010; 30:22: 7587–7597.
5. Ehret G. Book Chapters Psychoacoustics. In Auditory Psychobiology of the Mouse Willot J.F., Thomas C. C. Illinois: Springeld 1983: 13–53.
6. Huang R.S., Duan S., Shukla S.J., Kistner E.O., Clark T.A., Chen T.X. Identification of genetic variants contributing to cisplatin-induced cytotoxicity by use of a genomewide approach. Am J Hum Genet 2007;81:3: 427–437.
7. Jimenez A.M., Stagner B.B., Martin G.K., Lonsbury-Martin B.L. Age-related loss of distortion product otoacoustic emissions in four mouse strains. Hearing Research 1999; 138: 1: 91-105.
8. Jörs S., Grimm C., Becker L., Heller S. Genetic Inactivation of Trpml3 Does Not Lead to Hearing and Vestibular Impairment in Mice. PLoS One 2010; 5:12: 14317.
9. Oldenburg J., Fossa S.D., Ikdahl T. Genetic variants associated with cisplatin-induced ototoxicity. Pharmacogenomics 2008;9:10: 1521–1530.
10. Peters U., Preisler-Adams S., Hebeisen A., Hahn M., Seifert E., Lanvers C., Heinecke A., Horst J., Jürgens H., Lamprecht-Dinnesen A. Glutathione S-transferase genetic polymorphisms and individual sensitivity to the ototoxic effect of cisplatin. Anticancer Drugs 2000;11:8: 639–643.
11. Poirrier A.L., Van den Ackerveken P., Kim T.S., Vandenbosch R., Nguyen L., Lefebvre P.P., Malgrange B. Ototoxic drugs: difference in sensitivity between mice and guinea pigs. Toxicol Lett 2010; 193:1: 41-49.
12. Probst R., Harris F.P., Hauser R. Clinical monitoring using otoacoustic emissions. Br J Audiol 1993; 27: 2: 89-90.
13. Probst R., Lonsbury-Martin B.L., Martin G.K. A review of otoacoustic emissions. Acoust Soc Am 1991; 89: 5: 2027-2067.
14. Quddusi T., Blakley B.W. Comparison of three methods of testing hearing in mice. J Otolaryngol Head Neck Surg. 2009; 38:3:318-322.
15. Reisinger E., Bresee C., Neef J., Nair R., Reuter K., Bulankina A., Nouvian R., Koch M., Bückers J., Kastrup L., Roux I., Petit C., Hell S.W., Brose N., Rhee J.S., Kügler S., Brigande J.V., Moser T. Probing the functional equivalence of otoferlin and synaptotagmin 1 in exocytosis. J Neurosci. 2011; 31: 13: 4886–4895.
16. Riedemann L., Lanvers C., Deuster D., Peters U., Boos J., Jürgens H., am Zehnhoff-Dinnesen A. Megalin genetic polymorphisms and individual sensitivity to the ototoxic effect of cisplatin. Pharmacogenomics 2008;8: 1: 23–28
17. Ross C.J., Katzov-Eckert H., Dubé M.P., Brooks B., Rassekh S.R., Barhdadi A., Feroz-Zada Y., Visscher H., Brown A.M., Rieder M.J., Rogers P.C., Phillips M.S., Carleton B.C., Hayden M.R.. Genetic variants in TPMT and COMT are associated with hearing loss in children receiving cisplatin chemotherapy. Nat Genet 2009;41:12:1345– 1349
18. Sockalingam R., Freeman S., Cherny T.L., Sohmer H. Effect of high-dose cisplatin on auditory brainstem responses and otoacoustic emissions in laboratory animals. Am J Otol 2000; 21:4: 521-527.
19. Steel K.P., Bock G.R.. Hereditary inner-ear abnormalities in animals. Relationships with human abnormalities. Arch. Otolaryngol 1983;109:1:22–29
20. Treuting P. M., Dintzis S.M. Book Chapters Special Senses: Eara In Comparative Anatomy and Histology A Mouse and Human Atlas. Treuting P. M., Dintzis S.M. London: Elsevier 2012: 420 -432.
21. Willott J.F., Turner J.G., Carlson S., Ding D., Seegers Bross L., Falls W.A. The BALB/c mouse as an animal model for progressive sensorineural hearing loss. Hear Res 1998; 115: 1: 162-74.
22. Zheng Q.Y., Johnson K.R., Erway L.C.. Assessment of hearing in 80 inbred strains of mice by ABR threshold analyses. Hear Res. 1999l; 130:1: 94–107.