18 июня 2017г.
Атеросклероз - болезнь «образа жизни», одна из серьезных проблем здравоохранения развитых стран, в том числе и России. Казалось бы, терапия гиполипидемическими препаратами – статинами, должна была полностью решить эту проблему. Однако, несмотря на эффективность и относительную безопасность статинов, в ряде случаев пациенты отмечают резко возникающие мышечные боли, иногда даже при повторном приёме одного и того же лекарственного препарата. Это специфический побочный эффект статинов - статиновая миопатия, чёткое понимание патогенеза которой, до сих пор отсутствует.
В ранее проведённых исследованиях нами установлено, что длительное введение высоких доз имвастатина сопровождается развитием гипоксии, характеризующейся нарушением кислородтранспортной функции эритроцитов и биоэнергетических процессов в мышцах экспериментальных животных [3,4,6].
Поскольку гипоксическое повреждение клетки реализуется путём активации сложного комплекса молекулярных механизмов, одним из которых является интенсификация перекисного окисления липидов (ПОЛ), то выявление динамики антиоксидантных ферментативных реакций позволит оценить вклад свободно-радикальных процессов в развитие миотоксичности статинов.
Исследования последних десятилетий показали, что сократительная активность саркомера зависит от полноценности гигантского белка поперечно-полосатых мышц - тайтина, выполняющего полифункциональную роль в саркомере. Тайтин играет ключевую роль в регуляции актин-миозинового взаимодействия и обеспечении внутриклеточных взаимодействий [1]. Уменьшение содержание тайтина обусловлено преобладанием процессов протеолиза этого белка над его синтезом, что приводит к нарушению упорядоченной структуры мышечного волокна. И может являться критерием диагностики миопатии.
В связи с этим, целью работы явился анализ биохимических изменений в мышечной ткани, а также комплексный анализ состояния молекулярной структуры мышечного волокна после длительного приёма симвастатина.
Исследование проводилось на беспородных крысах-самцах в возрасте 12-14 месяцев. Содержание животных соответствовало санитарным правилам СП 2.2.1.3218-14 “Санитарно-эпидемиологические требования к устройству, оборудованию и содержанию экспериментально-биологических клиник (вивариев)” от 29.08.2014. Животные были разделены на две группы. В первую группу входили интактные животные (35 особей), которые содержались на общем рационе вивария.
У крыс второй группы (экспериментальная группа) индуцировали эссенциальную гиперхолестеринемию, путём содержания в течение 3х месяцев на рационе, обогащённом животными жирами (топлённое сливочное масло) и легко усваиваемыми углеводами (тростниковый сахар, манная крупа).
По истечении этого срока животные экспериментальной группы были разделены на две подгруппы: подгруппа 2.1 (35 особей), получавших рацион без добавления лекарственных веществ; подгруппа 2.2 (35 особей), получавших в течение 2-х месяцев симвастатин (Zocor, 20 мг) по 0,001 г/ 100 г массы один раз в сутки в виде водной суспензии через пищеводный зонд.
По окончании срока эксперимента животных забивали декапитацией. Все манипуляции выполнялись в соответствии с принципами Хельсинской декларации (1964 г.).
Для оценки динамики холестеринового обмена определяли уровень общего холестерина (ХС) в сыворотке крови на анализаторе Bayer. Для исследования отбирали фрагменты скелетных мышц с задней лапы животного. В надосадочной жидкости определяли концентрацию восстановленного глутатиона (GSH) [5], активность супероксиддисмутазы (СОД) [5], каталазы [5], глутатионредуктазы (ГР) [5], глутатионпероксидазы (ГПО) [5].
Выделение изоформ тайтина и небулина проводили по методике, разработанной в ИТЭБ РАН (г. Пущино) [1]. Содержание изоформ тайтина (NT- и N2A-) и небулина проводили в пересчёте на содержание тяжёлых цепей миозина (ТЦМ).
Статистическую обработку экспериментальных данных проводили с использованием программы STATISTICA 6.0. Статистически достоверными считали отличия, соответствующие оценке ошибки вероятности р ≤ 0,05.
Содержание животных на рационе, обогащённом животными жирами и углеводами (подгруппа 2.1), способствовало статистически значимому повышению уровня холестерина относительно контрольной группы.
Введение симвастатина животным подгруппы 2.2 (экспериментальная гиперхолестеринемия + симвастатин) способствовало снижению уровня ХС в сыворотке крови до 1,637±0,136 ммоль/л, что достоверно не отличалось от показателей контрольной группы.
В мышцах животных с экспериментальной гиперхолестеринемией (подгруппа 2.1) также были выявлены разнонаправленные изменения активности ферментов антиоксидантной защиты.
Так, активность СОД достоверно не отличалась, активность каталазы была увеличена на 82,66 % (p<0,001) относительно контрольной группы. Активность ГПО была снижена на 49,47 % (p<0,001) на фоне значительного увеличения активности ГР – на 109% (p<0,001) и концентрации GSH – на 235,36 % (p<0,001) по сравнению с контрольной группой.
Полученные данные свидетельствуют о формировании дисбаланса в организации ферментативной антиоксидантной защиты.
Введение симвастатина животным с экспериментальной гиперхолестеринемией (подгруппа 2.2) способствовало снижению активности СОД на 53,2% (p<0,001), активность каталазы осталась без изменений относительно показателей животных, не получавших симвастатин (подгруппа 2.1). Относительно значений контрольной группы активность СОД была снижена на 54 % (p<0,001), каталазы, напротив, повышена на 86,48 % (p<0,001).
В исследуемой группе выявлены значительные изменения активности глутатионзависимых ферментов: дальнейшее снижение активности ГПО на 63,13 % (p<0,001), ГР на 37,5 % (p<0,001) и концентрации GSH на 49,93 % (p<0,001) относительно показателей подгруппы 2.1. При сравнении результатов с показателями контрольной группы активность ГПО была снижена на 81,37 % (p<0,001), ГР достоверно не отличалась, уровень GSH был повышен на 68,25 % (p<0,001).
Характерной особенностью метаболического ответа мышечной ткани на введение высокой дозы симвастатина является резкое снижение активности СОД и ГПО. Являясь основными антиоксидантными ферментами митохондрий и клеточных мембран, СОД и ГПО эффективно регулируют ПОЛ, препятствуя выходу цитохрома с и предотвращая апоптоз при действии факторов, индуцирующих окислительный стресс [2].
В тоже время, повышение уровня GSH является адаптивным механизмом, направленным на предотвращение окислительной модификации важнейших макромолекул, повышение резистентности миоцитов и сохранение их жизнеспособности [2].
У животных экспериментальной группы, было выявлено снижение содержания NT-изоформы тайтина до 0,019 и более, N2A-изоформы до 0,091 и более, практически полное отсутствие небулина по сравнению с контрольной группой. При этом регистрировали увеличение содержание протеолитических фрагментов тайтина (Т2) в 1,3 раза, что отражает наличие дистрофических процессов в мышце.
Анализируя полученные данные, можно полагать, что одним из молекулярных механизмов, лежащих в основе миотоксичности статинов при их длительном применении, является дезорганизация реакций ферментативной антиоксидантной защиты, приводящая к деструкции мышечного волокна и превалированию процессов протеолиза.
Полученные результаты дают основания использовать их как теоретическую основу для разработки схем метаболической коррекции при длительном применении высокодозовой терапии статинами для поддержания функционального состояния скелетной мускулатуры. А определение уровня тайтина в биопсийном материале может быть использовано как ранний маркёр мышечной дистрофии при приёме статинов.
Список литературы
1. Вихлянцев И.М., Подлубная З.А. Новые изоформы тайтина (коннектина) и их функциональная роль в поперечно-полосатых мышцах млекопитающих. Факты и предположения. // Успехи биологической химии. – 2012. – Т. 52. – С. 239-280.
2. Калинина Е.В. Современные представления об антиоксидантной роли глутатиона и глутатионзависимых ферментов./ Е.В. Калинина и [др.] // Вестник РАМН. – 2010. - № 3. – С. 46– 54.
3. Микашинович З.И. Анализ биохимических изменений в эритроцитах крыс при длительном приеме симвастатина. /З.И. Микашинович, Е.С. Белоусова// Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2013. – Т. 55. № 5. – С. 576 – 579.
4. Микашинович З.И. Биохимические изменения в эритроцитах как молекулярный индикатор клеточного повреждения при длительном введении симвастатина. /З.И. Микашинович, Е.С. Белоусова // Клеточные технологии в биологии и медицине. – 2016. - № 2. – С. 122 – 126
5. Микашинович З.И. Биохимические исследования слюны в клинической практике. / З.И. Микашинович и [др.] // изд-во РостГМУ, Ростов н/Д.– 2004.– С.80.
6. Микашинович З.И. Нарушение энергозависимых процессов в мышечной ткани как один из патогенетических механизмов статиновой миопатии. /З.И. Микашинович, Е.С. Белоусова// Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2016. – Т. 162. № 10. – С. 426 – 430.