ИЗУЧЕНИЕ НЕСТАБИЛЬНОСТИ ГЕНОМА ПОТОМКОВ В СЕМЬЯХ РАБОТНИКОВ ПО «МАЯК»

Аннотация
Для оценки риска отдаленных генетических эффектов у потомков при облучении родителей проведено изучение трансмиссии геномной нестабильности в 95 семейных тройках работников ПО Маяк, в которых только отцы подверглись профессиональному пролонгированному облучению. Средняя величина суммарной преконцептивной поглощенной дозы (СППД) внешнего гамма-излучения в гонадах отцов составила 1,65 ± 0,08 Гр (диапазон 0,57 – 5,70 Гр), а средняя величина СППД внутреннего альфа-излучения от инкорпорированного Pu–239 в гонадах – 0,0015 ± 0,0003 Гр (диапазон 0,000 – 0,015 Гр). Контрольную группу составили 50 семейных троек, в которых родители не подвергались профессиональному облучению.
Для исследования трансмиссии геномной нестабильности в поколениях использованы биологические образцы Банка ДНК работников ПО «Маяк» и их семей, созданного в клиническом отделе Южно-Уральского института биофизики. Исследование проведено с использованием ПЦР-анализа на основе сателлитных маркеров: минисателлитной области гена CSTB и минисателлита CEB1 (локус D2S90). Исследование показало отсутствие мутаций, связанных с изменением количества повторов, в минисателлитной области гена CSTB как в основной, так и контрольной группах. Выявлена тенденция увеличения частоты мутаций минисателлита CEB1 в общей группе семей с отцами, подвергшимся облучению, и в группе семей с отцами, подвергшимся облучению в диапазоне доз 0,5 – 1,0 Гр по сравнению с контролем с достигнутым уровнем значимости р = 0,109 и р = 0,058, соответственно.
Введение
Одной из актуальных задач как радиационной медицины, так и радиационной защиты является изучение трансмиссии геномной нестабильности от облученных родителей к их потомкам. К настоящему времени наличие генетических эффектов радиационного воздействия не доказано, что отражено в выводах международных организаций (НКДАР, МКРЗ, BEIR) [1, 3, 9]. Однако, поскольку трансгенерационные эффекты были показаны в эксперименте на животных, в научных обобщениях международных организаций риск наследственных эффектов радиации у человека не отрицается и трактуется как нерешенная проблема с рекомендацией дальнейших исследований в этой области. В настоящее время для изучения геномной нестабильности используют более чувствительные методы, основанные на молекулярно-генетических технологиях поиска мутаций в гипервариабельных некодирующих областях генома, в которых частота спонтанного мутагенеза в 103 выше, чем в кодирующих генах [13, 14]. Такие исследования проведены на различных группах потомков, родители которых подверглись облучению при различных радиационных авариях и инцидентах, а также потомков работников предприятий атомной промышленности [4-8, 15, 18]. Однако, из-за низкой частоты мутагенеза у человека, составляющей 2 х 10-7 мутаций /ген/клетку для обнаружения генетических нарушений у потомков необходима очень большая статистическая мощность исследуемых когорт [12], что подчеркивает необходимость продолжения таких исследований.
Целью настоящего исследования являлось изучение мутационного процесса в гипервариабельных областях генома: минисателлитной области гена CSTB и минисателлита CEB1 (локус D2S90) в виде изменений количества повторов в семьях работников ПО «Маяк», в которых профессиональному облучению подверглись только отцы.
Материалы и методы
Для проведения исследования использован биологический материал Банка ДНК работников ПО «Маяк» и их семей [16]. Образцы крови были взяты после подписания участниками исследования «Информированного Согласия» на добровольное участие в исследовании и «Согласия на обработку персональных данных» согласно российскому законодательству (закон РФ №5487-1 от 22.07.1993 и закон РФ №152-ФЗ от 27.07.2006). Профессиональные маршруты и дозовые характеристики родителей, работников ПО «Маяк», получены из медико-дозиметрической Базы Данных «Клиника» [10].
Для изучения трансмиссии геномной нестабильности были сформированы основная и контрольная группы. Основную группу составили 95 семейных троек (мать, отец, ребенок), в которых облучению подверглись только отцы. Контрольную группу составили 50 семейных троек. На момент исследования члены контрольных троек являлись жителями города, никогда не работали на ПО «Маяк», не подвергались профессиональному облучению, а также не проживали на радиоактивно загрязненных территориях и не участвовали в ликвидации последствий радиационных аварий. Установление биологического родства членов семей, включенных в исследование, проведено с помощью 9 маркеров стандартизованной системы GenePrint STR System.
Определение мутаций в виде инсерций или делеций единиц повторов минисателлитной области гена CSTB и минисателлита CEB1 (локус D2S90) было проведено с помощью ПЦР-реакции с использованием специального комплекса реактивов Long PCR Enzyme mix согласно рекомендациям производителя [17]. Для исключения ошибок при выявлении мутаций путем сравнения аллельных профилей детей с аллельными профилями родителей проводили двух – трехкратные проверочные амплификации каждой семейной тройки. При анализе профилей учитывали смещения аллельных полос, составляющие более 2 повторов каждого из минисателлитов: 20 п.н. для минисателлитной области гена CSTB и 80 п.н. для минисателлита CEB1 [2].
Оценку статистической значимости различий в группах проводили с помощью непараметрического критерия 2 в пакете «Statistica 6.0» с учетом одной степени свободы для четырехпольной таблицы, и уровнем значимости p ≤ 0,05 [11].
Результаты
Для проведения исследования из семей Банка ДНК была выбрана основная группа (95 троек), в которой только отцы подверглись преконцептивному облучению. При этом средняя СППД внешнего гамма-излучения в гонадах отцов составила 1,65 ± 0,08 Гр, а средняя СППД внутреннего альфа-облучения от инкорпорированного Pu–239 в гонадах – 0,0015 ± 0,0003 Гр. На момент взятия биологического материала средний возраст отцов составил 71,32 ± 0,64 года, матерей – 68,89 ± 0,57 лет, детей – 41,01 ± 0,59 лет. Группу контроля составили 50 семейных троек. На момент взятия биологического материала средний возраст отцов в тройках контрольной группы составил 70,48 ± 0,72 года, матерей – 68,52 ± 0,74 лет, детей – 43,08 ± 0,81 года. Статистически значимых различий возраста на момент взятия биологического материала между изучаемыми группами не выявлено (p > 0,05).
Примеры исследования мутационного процесса в минисателлитных областях семей, в которых только отцы подверглись преконцептивному облучению, приведены на рисунке 1. Во всех исследованных семьях, как основной группы, так и контрольной, не обнаружено мутаций, связанных с изменением количества повторов в минисателлитной области гена CSTB. При исследовании мутаций минисателлита CEB1, связанных с делецией/инсерцией единиц повтора, было выявлено 10 мутаций, 7 из них являлись делециями. Девять мутаций были обнаружены в основной группе, и одна мутация – в контрольной группе. Отцовский тип наследования (т.е. мутация исходной отцовской аллели) имел место в 80% случаев – 8 мутаций из 10. Установлено, что частота мутаций в основной группе семей была выше по сравнению с контролем с достигнутым уровнем значимости р = 0,109 по критерию хи-квадрат (Табл.1).


       Рис.1. Результаты исследования мутационного процесса в семьях работников ПО «Маяк» Условные обозначения: F – отец; C – ребенок; M – мать; L – маркер молекулярной массы.
А – Исследование минисателлитной области гена CSTB на примере семьи 789 (отец, мать, один ребенок) основной группы. Ни аллели отца, ни матери в аллельном профиле ребенка мутаций в виде инсерций или делеций не несут. Б – Исследование минисателлита CEB1 на примере семьи 527 (отец, мать, два ребенка) основной группы (инвертированное изображение). Аллели, пришедшие от отца, у обоих детей несут инсерцию.

* – среднее арифметическое ± стандартная ошибка; х² – непараметрический критерий, p – достигнутый уровень значимости по сравнению с контрольной группой

Для анализа зависимости частоты выявленных мутаций от величины СППД внешнего гамма-излучения в гонадах отцов, основная группа была разделена на три подгруппы (0,5 – 1,0 Гр, 1,01 – 2,0 Гр и более 2,0 Гр (Табл. 2). Не выявлено различий частоты мутаций в изучаемых подгруппах. Но показана тенденция увеличения частоты мутаций в подгруппе семей, где отец подвергся суммарному преконцептивному облучению в дозе 0,5 – 1,0 Гр, по сравнению с контролем (р = 0,058, критерий хи-квадрат).

Примечание: * – среднее арифметическое ± стандартная ошибка; p – достигнутый уровень значимости по критерию 2 по сравнению с контрольной группой; min – max – границы доз, минимальное и максимальное значение.

Заключение
Исследование показало отсутствие мутаций в виде изменения количества повторов в минисателлитной области гена CSTB как в основной, так и контрольной группах.
Выявлена тенденция увеличения частоты мутаций минисателлита CEB1 в общей группе семей с отцами, подвергшимся преконцептивному облучению, и в группе семей с отцами, подвергшимся облучению в диапазоне доз 0,5 – 1,0 Гр по сравнению с контролем, что показало перспективность данного минисателлита как маркера нестабильности генома у потомков.
Предполагается продолжение начатого исследования с расширением числа привлеченных к анализу семейных троек на основе собранного биологического материала Банка ДНК работников ПО «Маяк» и их семей.

Список литературы

1. BEIR VII Report 2006. Phase 2. Health Risks from Exposure to Low Levels of Ionizing Radiation. Committee to Assess Health Risks from Exposure to Low Levels of Ionizing Radiation, National Research Council.
2. Bouffler S.D., Bridges B.A., Cooper D.N. et al. Assessing radiation-associated mutational risk to the germline: repetitive DNA sequences as mutational targets and biomarkers // Rad. Res. 2006. № 165. P. 249–268.
3. Dauer L.T., Brooks A.L., Noel D.G. et al. Review and evaluation of updated researches on the health effects associated with low-dose ionizing radiation // Radiat. Prot. Dosim. 2010. V. 140. N. 2. P. 103–136.
4. Dubrova Y.E., Bersimbaev R.I., Djansugurova L.B. et al. Nuclear weapons tests and human germline mutation rate // Science. 2002. V. 295. Р. 1037.
5. Dubrova Y. E., Grant G., Chumak A. A. et al. Elevated minisatellite mutation rate in the post-Chernobyl families from Ukraine // Am. J. Hum. Genet. 2002. V. 71. Р. 801–809.
6. Kiuru A., Auvinen A., Luokkamaki M. et al. Hereditary minisatellite mutations among the offspring of Estonian Chernobyl cleanup workers // Radiat. Res. 2003. V. 159. Р. 651–655.
7. Kodaira M., Izumi S., Takahashi N. and Nakamura N. No evidence of radiation effect on mutation rates at hypervariable minisatellite loci in the germ cells of atomic bomb survivors // Radiat. Res. 2004. V. 162. Р. 350– 356.
8. Slebos R. J. C., Little R. E., Umbach D. M. et al. Mini- and microsatellite mutations in children from Chernobyl accident clean-up workers // Mutat. Res. 2004. V. 559. Р. 143–151.
9. United Nations. UNSCEAR 2012. Report to the General Assembly, with Scientific Annexes. Annex «Biological mechanism of radiation action at low doses». United Nations. New York, 2012. 35 pp.
10. Азизова Т. В., Сумина М. В., Беляева З. Д. и др. Структура и характеристика медико-дозиметрической базы данных «Клиника» // Вопросы радиационной безопасности. 2006. Спецвыпуск 2. С.55–65.
11. Боровиков В. STATISTICA. Искусство анализа данных на компьютере для профессионалов. СПб: Питер, 2003. 688 с.
12. Бочков Н.П., Дурнев А.Д. Мутационный процесс у человека: Наследственные болезни. М.: Геотар– Медиа, 2012. С. 176–198.
13. Дуброва Ю.Е. Радиация и индукция мутаций в половых клетках человека // Радиационная биология. Радиоэкология. 2006. Т. 46. № 5. С. 537–546.
14. Котеров А.Н., Бирюков А.П. Дети ликвидаторов аварий на Чернобыльской атомной электростанции. 1. Оценка принципиальной возможности зарегистрировать радиационные эффекты // Медицинская радиология и радиационная безопасность. 2012. Т. 57. № 1. С. 5–21.
15. Площанская О.Г., Козионова О.С., Аклеев А.В., Дуброва Ю.Е. Анализ мутаций в минисателлитных локусах ДНК лиц из когорты реки Теча // Материалы III Международного симпозиума «Хроническое радиационное воздействие: медико-биологические эффекты». Челябинск. Октябрь 24–26, 2005. С. 95.
16. Русинова Г.Г., Глазкова И.В., Гурьянов М.Ю., Азизова Т.В. Банк ДНК облученных людей и их семей. Мотивы создания // Медицина экстремальных ситуаций. 2010. № 1. С.93–100.
17. Техническая инструкция к набору Long PCR System // фирма «Thermo Scientific», 2006.
18. Шайхаев Г.О., Кузьмина Н.С., Мязин А.Е. и др. Частоты мутаций в мини- и микросателлитных локусах ДНК в клетках членов семей работников атомной промышленности, работавших с тритием и его окисью // Радиационная биология. Радиоэкология. 2008. Т. 48. № 6. С. 690–697.