25 июня 2016г.
Авторами работы [5] было установлено, что содержание спиртов холестерина (ХС) и глицерина в плазме крови зависит от числа двойных связей (ДС) жирных кислот (ЖК) в пуле липидов (ЛП). Были проведены измерения кинетических параметров окисления индивидуальных ЖК в ЛП низкой плотности (ЛПНП) на основе: а) регистрации расхода окислителя озона (О3) и б) прироста продуктов реакции - диеновых коньюгатов [6]. Было установлено, что высокое содержание в пище пальмитиновой насыщенной ЖК (НЖК) - основная причина повышения содержания ХС в составе ЛПНП (ХС-ЛПНП), формирования синдрома атеросклероза и его основного клинического проявления – атероматоза интимы артерий.
Цель настоящей работы – на клиническом материале выяснить диагностическое значение методов определения ненасыщенности пула ЖК в плазме крови кардиобольных: а) прямым титрованием ДС озоном (метод физической химии) и б) путем расчета общего числа ДС на основании определения концентрации индивидуальных ЖК с помощью газовой хроматографии (клиническая биохимия). Обсудить биохимические реакции, которые увеличивают in vivo число ДС в цепи атомов углерода и повышают ненасыщенность ЖК, и их возможное диагностическое значение.
Была отобрана группа пациентов (31 человек), наблюдавшихся в 6-м клиническом отделении Института кардиологии ФГУ РКНПК МЗ РФ и имеющих различную патологию сердечно-сосудистой системы. Кровь бралась из локтевой вены, плазма отделялась от эритроцитов и хранилась при температуре -70ºС. Концентрация индивидуальных ЖК определялась на газовом хроматографе модели «Вариан 3900». Использовалась кварцевая капиллярная колонка с неподвижной жидкой фазой «Супелковакс-10» [1]. Применялись стандартные образцы ЖК и их смеси фирмы Супелко, и вычислились калибровочные коэффициенты для каждой ЖК. Концентрация индивидуальных неэтерифицированных ЖК (НЭЖК) определялась методом А. Kurkis. Для этого липиды, полученные экстракцией из плазмы по Фолчу, подвергались силанизации действием горячего бис(N,O- триметилсилил) трифторацетамида, а затем триметилсилильные эфиры НЭЖК определялись на газовом хроматографе [1]. Содержание в плазме крови триглицеридов (ТГ), ХС-ЛПНП и ХС-ЛПВП определялось
«прямым» ферментативным методом. Все биохимические анализы пациентов и определение общего содержания НЭЖК (энзиматический метод) проводились на анализаторе модели Архитект–800 с использованием биохимических наборов фирмы Диасис и Эбботт (США).
Для определения суммарного содержания ДС ([С=С]) в липидном пуле плазмы крови использовался метод озонирования, основанный на способности озона реагировать с ДС в ЖК с константой скорости порядка 105 – 106 М-1с. [4]. Липидную фракцию из плазмы крови экстрагировали хлороформом и обрабатывали смесью по Фолчу. Измерения выполнялись на анализаторе ДС АДС-4М, в котором УФ-спектрофотометр регистрирует концентрацию О3 на входе и выходе из реактора, а встроенный интегратор рассчитывает расход озона, пропорциональный числу ДС в образце. В качестве стандарта использовался стильбен с одной ДС, а для контроля работы прибора применялся β-каротин, имеющий 11 ДС [2]. Погрешность измерения числа ДС в липидном пуле плазмы крови при учете сходимости результатов составила ± 15%. Статистическая обработка результатов проводилась с помощью стандартных алгоритмов программы MS Excel. Достоверность различия величин считалась по t-критерию Стьюдента (t-тест). Использовалась 95%-я доверительная вероятность; достоверными считались различия при р ≤ 0,05 (t-тест<0,05) [3]. Липидами, мы полагаем, являются ЖК и все соединения, в состав которых входят ЖК. И если ХС и глицерин это спирты, то при ковалентной эфирной связи с ЖК они становятся липидами.
На Рисунке 1 представлены результаты измерения суммарного содержания ДС ([C=C]), полученные методом озонирования и рассчитанные по сумме ДС всех ЖК, исходя из данных хроматографии. Корреляция результатов оказалась достоверно достаточно высокой с r=0,883. Это свидетельствует о возможности оценки ненасыщенности ЖК более простым и дешевым методом по озону.
Число ДС в пуле липидов плазмы крови и НЭЖК достоверно характеризует такой параметр, как ненасыщенность ЖК. Этот параметр может быть повышен за счет увеличения концентрации как МЖК (мононенасыщенных ЖК), ННЖК (ненасыщенных), так и ПНЖК(полиеновых). Однако, если принять во внимание, что содержание НЖК+МЖК, ННЖК и ПНЖК в плазме крови соотносится как 90:10:1, достоверное повышение числа ДС отражает активность эндогенных реакций денатурации. Введение в цепь эндогенно синтезированной МЖК одной ДС является физиологично лимитированным и филогенетически более поздним, чем синтез in vivo пальмитиновой НЖК. Клетки приматов и человека могут ввести в эндогенные НЖК (С16:0 пальмитиновая и С18:0 стеариновая) только одну ДС. Ввести же в цепь МЖК вторую ДС с образованием С18:2 линолевой ННЖК могут только растения. Некоторые биохимические реакции регулируют синтез in vivo эндогенных НЖК и инициируют введение одной ДС. Например, увеличение ненасыщенности пула липидов в плазме крови происходит при превращении в печени пальмитиновой НЖК (С16:0), синтезированной из глюкозы, в С18:1 олеиновую МЖК, а активацию этого превращения инициирует инсулин. На Рисунке 2 представлены поля и коэфффициенты корреляции (r), которые были получены при количественном определении индивидуальных ЖК.
При росте содержания пальмитиновой ЖК С16:0 в НЭЖК содержание олеиновой ЖК С18:1 тоже возрастает (в) а
активность реакции является субстратзависимой. На рис. 2(d) отношение С18:1/С16:0 приведены в пуле ЛП в отношении пальмитиновой НЖК как субстрата и олеиновой МЖК - продукта реакции. Корреляция концентрации С16:1 и С18:1 с С16:0 оказалась высокой и в НЭЖК (а), и в липидном пуле (с). В пуле НЭЖК в плазме крови содержание ДС составило 0,439±0,13 ммоль/л, что в 40 раз ниже, чем в пуле всех липидов. Физиологично пул ЖК в НЭЖК в реализации биологической реакции эндотрофии (внутреннее питание) не может быть большим. Высокий градиент концентрации ЖК между плазмой крови и цитоплазмой клеток является причиной быстрого поглощения НЭЖК клетками. Полученные данные свидетельствуют о том, что количество индивидуальных ЖК и расчет общего числа ДС в них более информативно, чем определение числа ДС в общем пуле ЖК. В общем пуле ЖК в ЛП плазмы крови и в пуле НЭЖК были получены усредненные по 31 пациентам следующие значения:
Первое отношение отражает активность филогенетически ранней реакции десатурации, т.е. превращение пальмитиновой экзогенной С16:0 в пальмитолеиновую ω-7 С16:1. Второе отношение характеризует двухэтапное превращение пальмитиновой ЖК, эндогенно синтезированной из глюкозы, в C18:0 стеариновую ЖК, а далее в олеиновую ω-9 С18:1 МЖК. Реакция введения ДС состоит из двух: первую реакцию элонгации характеризует третье отношение; вторую реакцию десатурации - четвертое. Отношение С16:1/С16:0 характеризует увеличение ненасыщенности ЖК на ранних ступенях филогенеза: ω-7 С16:1 пальмитолеиновая МЖК для приматов и человека является афизиологичной: ее не поглощают и не окисляют митохондрии. В процессе оптимизации экзогенных ЖК в гепатоцитах, пальмитолеиновую МЖК окисляют пероксисомы с выделением тепла, но не
АТФ. В то же время, пальмитоил-КоА-десатураза увеличивает ненасыщенность пула ЖК ЛП. Отношение С16:1/С16:0 у человека низко; в пуле ЖК в ЛП и в НЭЖК оно составило 0,01:0,07. Отношение С18:1/С16:0 в пуле ЛП и ЖК пула НЭЖК составляет 0,68:0,78 - это результаы активности пальмитоил-КоА-элонгазы и стеарил-КоА- десатаразы. Отношение С18:1/С18:0 в липидах ЛП крови и пуле НЭЖК соотносится как 3,29:2,5. Это означает, что основное превращение эндогенной стеариновой НЖК в олеиновую МЖК происходит в гепатоцитах и формирует физиологично оптимальные олеиновые ТГ и одноименные ЛПОНП. Константа окисления озоном экзогенной ω-6 С18:1 олеиновой МЖК на 5-6 порядков выше константы окисления пальмитиновой НЖК [4]. Физико–химические расчеты энергии одинарной связи между атомами углерода в разных позициях алифатическй цепи, дают основание говорить, что константа скорости окисления митохондриями эндогенной ω-9 С18:1 олеиновой МЖК выше, чем экзогенной ω-6 С18:1 оливкового масла. Основное биологическое предназначение инсулина, по-видимому, состоит в превращении всей, синтезированной из глюкозы, пальмитиновой НЖК в эндогенную олеиновую МЖК. Чем более активно действие инсулина, тем больше ДС имеет пул ЖК в ЛП и в НЭЖК, т.е. выше ненасыщенность плазмы крови. Поэтому, регуляторное действие инсулина определяет такой параметр липидологии - ненасыщенность ЖК как основное условие, обеспечивающее максимальную производительность митохондрий и наработку АТФ.
Список литературы
1. Ариповский А.В., Колесник П.О., Веждел М.И., Титов В.Н. // Клиническая лабораторная диагностика. 2012. № 1. С. 3–8.
2.
Гагарина А.Б.,
Евтеева Н.М. // Химическая физика. 2002. Т. 21. №7. С. 41–49.
3.
Дерффель К. Статистика в аналитической химии. // М. Мир. 1994. 268 с.
4.
Лисицын Д.М., Разумовский С.Д., Тишенин
М.А., Титов В.Н.
// Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2004. Т. 138. №11. С. 517–519.
5.
Титов В.Н., Лисицын Д.М. // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2006. Т. 142. №11. С.521–524.
6. Титов В.Н., Коновалова Г.Г., Лисицын Д.М. и др. // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2005. Т. 140. №7. С. 45–47.
