ИЗУЧЕНИЕ АНТИГЕННЫХ СВОЙСТВ ИЗОЛЯТОВ ВИРУСА БОЛЕЗНИ АУЭСКИ И ЦИРКОВИРУСА ІІ ТИПА ВЫДЕЛЕННЫХ ОТ ДИКИХ СВИНЕЙ НА ТЕРРИТОРИИ УКРАИНЫ

В статье приведены данные антигенных свойств вируса болезни Ауески и цирковируса второго типа, выделенных из биологического материала диких свиней, отстрелянных на территории Украины. Изучение свойств изолятов вируса болезни Ауески проводились на культуре клеток ВНК. Была определена чувствительность изолятов вируса болезни Ауески к хлороформу, определено их инфекционную активность, антигенное родство в реакции нейтрализации и с помощью полимеразной цепной реакции в режиме реального времени выделено специфическую ДНК вируса. Представлены данные филогенетического анализа 23 изолятов цирковируса второго типа, выделенных от диких свиней. Результаты секвенирования показали, что изоляты принадлежат обоим генотипам, где 16 изолятов отнесены к групе 1А / 1Б, 2 изолята – к групе 1С, 4 изолята к групе 2D. Одна последовательность была некластеризованой.

Ключевые слова: вирус болезни Ауески, цирковирус 2-го типа, изоляты дикие свиньи, антигенные свойства К болезни Ауески - восприимчивы домашние животные (свиньи, КРС, овцы, козы, собаки, кошки), дикие животные (кабаны, обезьяны, барсуки, грызуны, кажаны, черепахи), пушные звери (кролики, песцы, норки, лисы) и другие [1]. Вирус болезни Ауески культивируется на куриных эмбрионах, первичных - почка ВРХ, обезьян, ягнят, свиней, и перевиваемых Hela, КЕМ-Ла, ПЕС, ППК-666, ППК-Д, ПСГК [9], BHK-21 [10], ПСГК-60 [1] культурах клеток с проявлением ЦПЭ. Штаммы вируса болезни Ауески в культурах клеток могут накапливатся в титрах от 102 - 103 до 108-109 ТЦД50 [1, 10].

Цирковирус свиней (PCV) впервые был выявлен I. Tisher, N. Rasch и G. Tochterman в 1974 году, и позднее охарактеризован в 1982 г. как мелкий вирус свиней с кольцевой одноцепочечной ДНК [4]. В настоящее время известно 2 типа цирковируса свиней, которые существенно отличаются нуклеотидной последовательностю геномов [7]. Штаммы PCV-2 являются патогенными для свиней, а PCV-1- непатогенными, но могут вызывать врожденные судорги [8]. Геном цирковирусов представлен односпиральной кольцевой молекулой ДНК длинной 1768 - для ЦВС-2 [6]. В целом учеными были определены две основные филогенетические групы PCV-2 – PCV-2a и PCV-2b. Штаммы PCV-2a циркулировали на свинофермах в некоторых странах с 1997 до 2003 года. После 2003 года штаммы PCV-2b стали более распространенными и регистрировались в Северной Америке и некоторых европейских странах [13]. Третий генотип - PCV-2c представлен только тремя последовательностями и циркулировал в Дании в 1980-е годы [12]. Четвертый генотип - PCV-2d есть новым и был выделен в Китае [14].

Целью наших исследований было определить антигенные свойства изолятов вируса болезни Ауески и секвенировать полный геном изолятов цирковируса второго типа, которые были выделены из биологического материала диких свиней отстрелянных на территории Украины.

Материалы и методы. Изучение культуральных свойств вируса болезни Ауески проводились в лаборатории вирусных болезней свиней ИВМ НААН. Выявление ДНК изолятов вируса болезни Ауески проводились совместно в рамках ранее подписанного договора № 01/11 от 15.04.2011 года о научно-техническом сотрудничестве между ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии и ИВМ НААН Украины. Исследования по определению ДНК изолятов цирковируса второго типа с последующим их секвенироваием проводилсь в Национальном ветеринарном Институте г.Пулавы, Польша. Геном изолятов цирковируса второго типа секвенировали в двух фрагментов на основе двух ранее опубликованных пар праймеров CBB1-CBB2 и CSZ2- CBB3 [11].

Результаты исследований. Биологический материал (суспензии лимфоидных органов) от диких свиней в количестве 211 образцов: с территории 17-ти районов Полтавской та 10-ти районов Черкаской областей были обработаны антибиотиками и хлороформом по методике [3] с последующим внесением в лунки пластикового микропланшета (по 2 лунки на каждый образец) с монослоем культуры клеток ВНК-21. В первом пассаже деструкцию монослоя клеток наблюдали с 3 по 5 сутки лишь в 5-ти лунках. В последующем содержимое 5-ти лунок, где выявлено деструкцию монослоя клеток было отобрано в отдельные пластиковые емкости, подвержено процедуре заморозки и проведено второй пассаж в культуре клеток. Цитопатическое действие (ЦПД) было отмечено с 3 по 5 сутки.

Суспензии биологического материала от диких свиней, которые вызывали ЦПД в культуре клеток были отобраны с таких территорий: № 1 - Миргородского, № 2 - Кобеляцкого, № 3 - Лубенского, № 4 Миргородского районов Полтавской области и № 5 - Золотоношского района Черкаской области.

В последующем было проведено еще 3 последовательных пассажей суспензий в культуре клеток с процедурами заморозки перед каждым ее инфицированием. Характер ЦПД был следующим: округление клеток, их уплотнение, дегенерация монослоя и его отслаивание в виде участков с неровными краями.

Результаты определения инфекционной активности изолятов вируса болезни Ауески в пяти пассажах приведены в Табл.1).

 Титр инфекционной активности вируса болезни Ауески в культуре клеток ВНК-21

Таблица 1

Примечание. n – количество повторов при исследованиях; min – минимальный показатель; max – максимальный показатель; M±m – средний арифметический показатель с отклонением.

По результатам титрования было определено инфекционную активность изолятов вируса болезни Ауески. Путем проведения 5-ти последовательных пассажей зарегистрировано повышение инфекционной активности изолята вируса № 1 до 5,68 ± 0,12 lg ТЦД50/см3, изолята № 2 до 3,99 ± 0,05 lg ТЦД50/см3, изолята № 3 до 5,8 ± 0,07 lg ТЦД50/см3, изолята № 4 до 5,88 ± 0,05 lg ТЦД50/см3, изолята № 5 до 5,18 ± 0,04 lg ТЦД50/см3.

Перед постановкой реакции нейтрализации с постоянной дозой сыворотки, что позволяет определить антигенное родство изолятов к вирусу болезни Ауески, в 5-м пассаже нами была отобрана вируссодержащая культуральная жидкость для проведения их идентификации в реакции нейтрализации с определением антигенного родства выделенных изолятов к штамму вируса болезни Ауески "Петриковский-2006". Титр вируса болезни Ауески штамм "Петриковский-2006" перед постановкой реакции был на уровне 7,7±0,24 lg ТЦД50/см3. Титр специфичной сыворотки крови к штамму "Петрикіовский-2006" был на уровне 1:1024, а для реакции брали 20 нейтрализующих доз сыворотки. В качестве неродственного вируса был использован штамм вируса болезни Тешена "Перечинский 642" с титром инфекционной активности 8,73 ± 0,13 lg ТЦД50/см3. Результаты реакции нейтрализации с постоянной дозой сыворотки приведены в Табл.2.

Результаты изучения антигенного родства изолятов вируса болезни Ауески

Таблица 2

По результатам постановки перекресной реакции нейтрализации с постоянной дозой сыворотки крови определено, что положительная сыворотка крови к штамму "Петриковский-2006" нейтрализовала 103,82 (8200) доз штамма вируса "Петриковский-2006", 103,28  (2800) доз изолята "Миргородский 1", 102,32  (320) доз изолята

"Кобеляцкий", 103,3 (3000) доз изолята "Лубенский", 102,57 (570) доз изолята "Миргородский 2", 103,11 (1100) доз изолята "Золотоношский", снизив их инфикционный титр на 3,82 lg, 3,28 lg, 2,32 lg, 3,3 lg, 2,57 lg та 3,11 lg соответственно. Для исключения возможности перекреста другими вирусами было проведено постановку реакции нейтрализации с положительной сывороткой крови к вирусу болезни Тешена штамм "Перечинский 642" и положительной сывороткой к нему. Инфекционная активность исследованных изолятов не понижалась, а соответствовала инфекционной их активности в присутствии отрицательной сыворотки крови с отсутствием антител против вируса болезни Ауески, в то же время как титр инфекционной активности вируса болезни Тешена штамм "Перечинький 642" понижался в присутствии положительной сыворотки крови к нему - ІН 4,04 lg ТЦД50/см3. Далее были определены показателии r, которые характеризуют антигенное родство, которое становило: изолята "Миргородский 1" к штамму "Петриковский - 2006" 0,86; изолята "Кобеляцкий" к штамму "Петриковский - 2006" 0,6; изолята "Лубенский" к штамму "Петриковский - 2006" 0,86; изолята "Миргородский 2" к штамму "Петриковский - 2006" 0,67%; изолята "Золотоношский" к штамму "Петриковский - 2006" 0,81.

С учетом предварительных результатов молекулярно-генетического мониторинга относительно выявления ДНК цирковируса второго типа нами были отобраны 59 положительных образцов суспензий биологического материала с 210 исследованных (15 в ВНИИВВиМ г.Покров, Россия и 195 в РУП Институт экспериментальной ветеринарии г.Минск, Белорусь) и направлены в Национальный ветеринарный Институт г.Пулавы, Польша с целью их секвенирования (Табл.2).

Таблица 2 Происхождение образцов биологического материала диких кабанов, которые были секвенированы в Национальном ветеринарном Институте г.Пулавы, Польша.

Показатели Табл.2 указывают на то, что в Национальном ветеринарном Институте г.Пулавы, Польша было секвенировано 23 образца биологического материала.

Филогенетический анализ 23 изолятов цирковируса второго типа показал, что штаммы от диких кабанов принадлежат обоим генотипам цирковируса второго типа, где 16 изолятов принадлежат групе 1А / 1Б, 2 изолята – к групе 1С, 4 изолята к групе 2D. Одна последовательность была некластеризованой.

Обсуждение. Полученные, в нашем опыте, результаты свидетельствуют о наличии в биологическом материале от диких свиней ДНК вируса болезни Ауески и цирковируса 2-го типа. Изоляты вируса болезни Ауески: "Миргородский 1", "Лубенский", "Золотоношский" имеют высокий уровень антигенного родства со штаммом "Петриковский-2006" (0,86; 0,86; 0,81) чем изоляты "Кобеляцкий" и "Миргородский 2" (0,6; 0,67).

Касательно изолятов цирковируса второго типа. В опытах А. С. Малоголовкина филогенетическим анализом показано их вариабельность с образованием нескольких генетических груп (кластеров). Автором высказывается мнение что такое генетическое разнообразие не связано с географическим ареалом распространения вируса, а связана с импортом племенных свиней в свиноводческие хозяйства России [5].

В научной работе А.П. Гериловича определено наличие трех подгруп украинских изолятов цирковируса, которые имели несколько иную нуклеотидную структуру - изоляты второго кластера способствовали развитию респираторных повреждений, в тоже время как две другие групы вирусов выявляли при репродуктивных, респираторных и смешанных форм течения цирковирусной инфекции у домашних свиней [2]. Результаты проведеных молекулярно-генетических исследований с секвенированием полного генома 23 украинских изолятов цирковируса второго типа свидетельствуют о том, что филогенетически украинские изоляты от диких свиней принадлежат двум генотипам и групам 1А, 1В, 1С, 2D в пределах этих генотипов.

Выводы. 1. Полученные в ходе исследований данные свидетельствуют о том, что выделенные изоляты относятся к вирусу болезни Ауєски. Изоляты "Миргородский 1", "Лубенский" та "Золотоношский" имели болем високие урони антигенного родства к штамму "Петриковский-2006" – показатель r = 0,86; 0,86 и 0,81 соответственно в то время как изоляты "Кобеляцкий" и "Миргородский 2" имели антигенное родство на уровнях 0,6 и 0,67 соответственно.

2. Результаты проведеных молекулярно-генетических исследований с секвенированием полного генома 23 изолятов цирковируса второго типа свидетельствуют о том, что филогенетически украинские изоляты от диких кабанов принадлежат двум генотипам и групам 1А, 1В, 1С, 2D в пределах этих генотипов.

Автор статьи высказывает глубокую благодарность дирекции и коллективу ВННИИВВиМ Россельхозакадемии и Национального ветеринарного Института, г.Пулавы Польша за представленную возможность в проведении молекулярно-генетических исследований

Список литературы

1.      Болезнь Ауески // Вирусные болезни животных / В. Н. Сюрин, А. Я. Самуйленко, Б. В. Соловьев, Н. В. Фомина. – М. : ВНИТИБП, 1998. – С. 603–630.

2.      Герілович А.П. Експериментальне і теоретичне обґрунтування та розробка засобів епізоотологічного моніторингу, діагностики вірусних хвороб тварин та молекулярно-генетичного типування їх збудників (ортоміксо-, параміксо-, герпес-, цирко- та пестивірусна інфекції) : автореф. дис. на здобуття наук. ступеня д-ра вет. наук : спец. 16.00.03 "Ветеринарна мікробіологія, епізоотологія, інфекційні хвороби та імунологія" / А.П. Герілович. – Х., 2011. – 42 с.

3.      Лярски З. Диагностика вирусних болезней животных / Москва, Колос, 1980. 400 с.

4.      Малоголовкин А. С. Проблема цирковирусных инфекций в патологи животных и человека // Веткорм. 2008. № 2. С. 30-31.

5.      Малоголовкин А. С. Биологические и генетические характеристики цирковирусов свиней : автореф. дис. на соискание уч. степени канд. биол. наук : спец. 03.00.06 «Вирусология», 03.00.23 «Биотехнология» / Малоголовкин А. С. . – Покров, 2009. – 27 с.

6.      Малоголовкин А. С. Выделение цирковируса свиней 2-го типа от поросят с синдромом мультисистемного истощения отъемышей / А. С. Малоголовкин, Г. А. Надточей, Д. В. Колбасов // Ветеринарный врач.  – 2009. – № 2. – С. 27–30.

7.      Мониторинг инфекционных болезней  среди  диких  кабанов  /  А. В. Щербаков,  С. А. Кукушкин, А. М. Тимина и др. // Вопросы вирусологии. 2007. Т. 52, № 3. С. 29–33.

8.      Орлянкин Б. Г., Алипер Т. И., Непоклонов Е. А. Цирковирусная инфекция свиней // Ветеринария с.-х. животных. 2006. № 12. С. 17–21.

9.      Оценка некоторых биологических  свойств  штаммов  вируса  болезни  Ауески  /  В. И. Жестерев, В. А. Мищанин, Р. В. Кошелева [и др.] // Актуальные вопросы ветеринарной вирусологии : материалы науч.-практ. конф. ВНИИВВиМ «Классическая чума свиней – неотложные проблемы науки и практики», 9–11 нояб. 1994 г. – Покров, 1995. – С. 131–132.

10.   Ясенева Е. А. Динамика накопления полноценного вируса болезни Ауески маркированного штамма ―ВК‖ в перевиваемой линии клеток ВНК-21 / Е. А. Ясенева // Ветеринарная патология. – 2006. – № 4. – С. 107-108.

11.   Cságola A, Kecskeméti S, Kardos G, Kiss I, Tuboly T. Genetic characterization of type 2 porcine circoviruses detected in Hungarian wild boars. Arch Virol. 2006 Mar;151(3):495-507.

12.   Genomic analysis of PCV2 isolates from Danish archives and a current PMWS case-control study supports a shift in genotypes with time / K. Dupont, E. O. Nielsen, P. Baekbo, L. E. Larsen // Veterinary Microbiolog. – 2008. – Vol. 128. – P. 56–64.

13.   PCV-2 genotype and nomenclature / J. Segales, A. Olvera, L. Grau-Roma [et al.] // Veterinary Record. – 2008. – Vol. 162. – P. 867–868.

14.   Porcine circovirus type 2 (PCV2): Genetic variation and newly emerging genotypes in China / L. J. Guo, Y. H. Lu, Y. W. Wei [et al.] // Virology Journal. – 2010. – Vol. 7. – P. 273.