12 марта 2016г.
Бактериофаги широко распространены в природе. Они обнаруживаются везде, где есть бактерии – их хозяева. Их можно выделить из почвы, различных водоемов, сточных вод, пищевых продуктов, из различных выделений человека и животных (моча, фекалии, гной и др.), а также из соответствующих культур бактерий, в которых они присутствуют в форме профага [5, 7].
Так, при размножении лизогенной культуры возможна спонтанная индукция, в результате которой часть клеток популяции лизируется и выделяет зрелые частицы специфичного для этой популяции бактериофага. Образовавшийся фаг обладает всеми свойства вирулентного фага, способного репродуцироваться, инфицировать другие клетки [8].
Но не все культуры, содержащие профаг, способны спонтанно лизироваться. Одни обладают такой способностью, но продуцируют бактериофаг в малых количествах. Другие требуют применения методов стимуляции.
Продукцию фагов лизогенными бактериями можно вызвать либо увеличить, воздействуя на клетки индуцирующими факторами: физическими, химическими, антибиотиками, а также путем создания в среде избытка определенных питательных веществ и витаминов [8].
Для выделения бактериофага необходимо подобрать оптимальные параметры воздействия на бактериальную клетку индуцирующих факторов. При выборе индуцирующего агента необходимо учитывать биологические особенности как лизогенных культур, так и выделяемых бактериофагов, их резистентность к тем или иным физическим и химическим факторам. Используемый агент должен инактивировать бактериальные клетки, но не должен оказывать угнетающего воздействия на фаг, снижать его литическую активность.
Известно, что большинство вирусов бактерий термостабильны. Они могут выдерживать температуру до 64 оС [6], а некоторые проявляют устойчивость к воздействию температуры до 75 оС [2]. Это свойство используют для выделения фагов [1]. Однако как показали в своей работе И.Р. Насибуллин и соавт., высокие температуры существенно снижают литическую активность некоторых фагов, поэтому данный метод не получил широкого распространения [6].
Еще одним агентом, применяемым для выделения бактериофагов, является хлороформ. Именно обработка хлороформом по данным, представленным в статье [4], является более эффективным методом выделения фага из бульонных культур Y.pseudotuberculosis в сравнении с методами прогревания и обработки культур 15% раствором мочевины. Но не все фаги обладают устойчивостью к хлороформу. Чувствительными к данному химическому агенту оказались, например, все исследуемые штаммы аэромонадных бактериофагов [6].
Недостаточно распространенным, но, в свою очередь, весьма эффективным является метод индукции профага рентгеновским облучением. В автореферате Н. Карамышевой [2] описаны различные режимы воздействия рентгеновским излучением на бактерии D. Desulfuricans. Наиболее оптимальным для получения фагов, по результатам проведенных исследований, оказался режим облучения, при котором время воздействия индуцирующего фактора составило два периода по 1,6 сек (доза 4,0 мЗв).
Самым часто применяемым и результативным способом превращения профагов в вирулентные фаги, по данным отдельных исследований, является способ облучение лизогенных культур УФ-лучами [1, 2, 3]. Для каждого штамма бактериофага плотность среды при облучении, расстояние до источника света, время экспозиции и длина волны подбираются экспериментальным путем.
В автореферате Н. Карамышевой [2] кроме метода индукции рентгеновским облучением описан опыт выделения фага УФ облучением. В результате применения УФ облучения ей удалось индуцировать профаг бактерий D. desulfuricans. Условия воздействия индуцирующего агента в эксперименте были следующими [2]:
· расстояние до источника облучения – 38 см;
· время экспозиции – 10 мин;
· длина волны – 250 нм.
В работе Ковалевой Е.А. и соавт. показано, что при применении 3 схем эксперимента наиболее оптимальной для выделения бактериофага Listeria monocytogenes оказалась схема, в которой при применении УФ-лучей были использованы следующие условия [3]:
· расстояние до источника облучения – 40 см;
· время экспозиции – 30 с;
· длина волны – 254 нм.
По данным Васильевой Ю.Б. и соавт. [1], наилучшей оказалась методика многократного последовательного облучения УФ бактериальных клеток. Наиболее эффективными оказались условия проведения эксперимента, при которых:
1 день. Газоном сеяли суточную культуры B. bronchiseptica на МПА, подсушивали ее в термостате 10-15 мин, облучали УФ-лучами, используя длину волны 253 нм, с расстояния 1 м в течение 5-7 мин. Засеянные и обработанные чашки Петри инкубировали в термостате при 37˚С в течение суток.
2 день. Распределяли шпателем выросшую бактериальную массу по поверхности агара, облучали ее УФ- лучами с длиной волны 253 нм с расстояния 1 м в течение 7-10 минут. Чашки Петри с содержимым инкубировали в термостате при 37 оС в течение суток.
3 день. Повторно распределяли шпателем выросшие колоний бактерий по поверхности среды, облучали бактерии УФ-лучами с той же длинной волны с расстояния 0,5 м в течение 7-10 минут. Чашки Петри с содержимым инкубировали при том же режиме.
4 день. Выросшие колонии смывали с чашки Петри мясопептонным бульоном и переносили в пробирку со штаммами B. bronchiseptica. Культивирование проводили в термостате при том же режиме.
5 день. В пробирку добавляли хлороформом в соотношении объемов 1:10 (хлороформ: среда), инкубировали содержимое пробирки в течение 15 минут, после чего проводили центрифугирование при 3000 об/мин в течение 15 мин. По окончанию центрифугирования надосадочную жидкость переносили в стерильную пробирку.
На 6 день проводили учет результатов. Надосадочную жидкость исследовали по методу агаровых слоев.
Присутствие бактериофага определяли по наличию зон лизиса.
Таким образом, сравнительный анализ научных исследований, посвященных применению различных факторов индукции, показал, что для выделения умеренных бактериофагов из лизогенных культур наиболее эффективным является метод индукции профага УФ облучением. Оптимальные условия воздействия индуцирующего фактора на бактериальные клетки для получения конкретного бактериофага подбираются экспериментальным путем.
Список литературы
1. Васильева, Ю.Б. Разработка методов выделения и селекции бактериофагов Bordetella bronchiseptica / Ю.Б. Васильева, Д.А. Васильева, Е.Н. Семанина // Бактериофаги: теоретические и практические аспекты применения в медицине, ветеринарии и пищевой промышленности: материалы Междунар. науч.-практ. конф., 23-25 апреля 2013 г, Ульяновск: Ульяновская государственная сельскохозяйственная академия им. П.А. Столыпина, 2013. – С. 28-32.
2. Карамышева, Н.Н. Выделение бактериофага desulfovibrio desulfuricans и создание на его основе биопрепарата по профилактике коррозии металлов в нефтяной промышленности: автореф. дис. на соиск. учен. степ. канд. биол. наук / Н.Н. Карамышева. – Саратов, 2013. – 19 с.
3. Ковалева, Е.Н. Выделение бактериофагов Listeria monocytogenes методом индукции / Е.А. Ковалева [и др.] // Вестник Ульяновской государственной сельскохозяйственной академии, 2013. – № 1 (21). – С. 45-48.
4. Македонова, Л.Д. Бактериофаги Yersinia pseudotuberculosis: обнаружение в штаммах различных О- серотипов и их идентификация / Л.Д. Македонова [и др.] // Клиническая лабораторная диагностика, 2013. –№ 8. – С. 52-53.
5. Медицинская микробиология, вирусология и иммунология: том 2: учебник / Под ред. В.В. Зверева, М.Н. Бойченко. – М.: ГЭОТАР-Медиа, 2010. – 448 с.
6. Насибуллин, И.Р. Влияние физических, химических факторов и режимов хранения на литическую активность аэромонадных бактериофагов / И.Р. Насибулин, Д.А. Васильев, И.Г. Швиденко // Вестник Ульяновской государственной сельскохозяйственной академии, 2014. – № 3 (27). – С. 73-76.
7. Перетрухина, А.Т. Бактерийные и вирусные препараты: учебник для вузов / А.Т. Перетрухина, Е.И. Блинова. - М.: Академия Естествознания, 2010. – 241 с.
8. Поздеев, О.К. Бактериофаги (строение, свойства, практическое применение): учебно-методическое пособие для студентов / О.К. Поздеев, Е.Р. Федорова, Ю.В. Валеева. – Казань: КГМУ, 2012. – 50 с.
