12 марта 2016г.
Коллекции водорослей имеют огромное научное и прикладное значение. Ведущие мировые коллекции водорослей являются не только своеобразными «банками» для хранения генофонда водорослей, но и ведущими научно-исследовательскими центрами (Гайсина, 2008). Вместе с тем, исследователями неоднократно отмечалось, что поддержание коллекции – сложный, трудоемкий и очень ответственный этап работы (Гусев и др., 1964; Культивирование …, 1983; Панкратова, 2000; Сопрунова, 2005). Поскольку даже при посеве альгологически чистых культур необходимо поддержание строгой стерильности сред, посуды и оборудования. Кроме того, несмотря на сравнительную простоту приготовления минеральных сред, очень существенное значение имеют такие факторы как качество воды, агара, чистота используемых реактивов. Также очень большое значение имеют условия светового и температурного режима как в первые дни после посева, так и в последующее время культивирования (Методы…, 1975; Культивирование …, 1983).
Все это свидетельствует о важности разработки новых методических подходов при получении альгологически чистых культур микроводорослей, и создания унифицированной методики их коллекционного культивирования.
Целью исследований являлось получение альгологически чистых культур цианобактерий из накопительных культур циано-бактериальных сообществ, выделенных ранее из экосистем, подверженных влиянию антропогенных факторов.
Применялся метод многократного пересева культур на чашках Петри и пробирках со скошенным агаром (Методы…, 1975). Пересев проводился каждые 2 дня методом штриха, с помощью бактериальной петли и извлечения одиночной нити, используя тонкую иглу и световой микроскоп.
По результатам имеющихся данных о культивирования цианобактерий были подобраны следующие питательные среды:
1) минеральная среда ВG-11;
2) минеральная среда MN;
3) минеральная среда Chu;
4) минеральная среда Громова 6;
5) минеральная среда Громова 16.
Выделение альгологически чистой культуры продолжалось в течении 30 дней. Были использованы твердые (т), полутвердые (птв) и жидкие (ж) стерильные питательные среды (Табл.1).
Таблица 1
Агрегатное состояние среды и ее pH
|
|
ВG-11
|
Громова 6
|
Громова 16
|
Chu
|
MN
|
|
Ж
|
7,2
|
7,1
|
6,5
|
6,5
|
7,0
|
|
Т
|
7,0
|
6,5
|
7,3
|
6,0
|
6,5
|
|
Птв
|
7,3
|
7,3
|
5,5
|
7,0
|
7,4
|
Рост колоний наблюдался на всех питательных субстратах. Наиболее активный рост был отмечен на твердых и полутвердых средах BG-11, MN и Громов 6. На чашках Петри и пробирках со скошенным агаром колонии представляли собой темно-зеленые и зеленовато-синие пленки, стелящиеся по поверхности среды. На средах Громова 16 и Chu колонии представляли собой слизистые образования округлой формы от светло- молочного до, практически, прозрачного цвета.
Для идентификации вида была проведена микроскопия. С каждой среды, в которой наблюдался активный рост пленки, был приготовлен неокрашенный препарат – висячая капля. При рассмотрении препарата висячая капля со среды BG-11 были обнаружены фрагменты светло-зеленых септированных нитей. Длина септы составляла 0,5-0,9 мкм, ширина – 0,3-0,4 мкм. По результатам микроскопии выросшие колонии были, предположительно, определены как Oscillatoria amphibia (Определитель бактерий Берджи, 1997). При рассмотрении препарата висячая капля со среды MN были обнаружены фрагменты светло-зеленых септированных нитей, а так же округлые зеленые одиночные и парные клетки. Длина септы составляла 0,4-0,7 мкм, ширина – 0,4-0,5 мкм; диаметр клеток составлял 0,2-,05 мкм. По результатам микроскопии выросшие колонии были, предположительно, определены как Oscillatoria amphibia и Synechocystis sp. (Определитель бактерий Берджи, 1997). При рассмотрении препарата висячая капля со среды Громов 6 были обнаружены фрагменты светло-зеленых септированных нитей. Длина септы составляла 0,5-0,7 мкм, ширина – 0,3-0,5 мкм. По результатам микроскопии выросшие колонии были, предположительно, определены как Oscillatoria amphibia (Определитель бактерий Берджи, 1997).
Для колоний, у которых произошло обесцвечивание был проведен тест Грегерсена. В капле 3%-ного водного раствора КОН на предметном стекле эмульгируют бактериальную массу, взятую с плотной среды. Спустя несколько секунд после перемешивания за петлей тянутся слизистые нити, что указывает на принадлежность исследуемой колонии к грамотрицательному виду. Грамположительные колонии не образуют тянущихся нитей.
В результате исследования образцов, было выявлено, что колонии являются грамотрицательными.
Для идентификации вида была проведена люминесцентная микроскопия. Использовали способность живых цианобактериальных клеток испускать красное свечение при облучении ультрафиолетом. В ходе люминесцентной микроскопии обесцветившихся колоний были обнаружены красные светящиеся септированные нити. Длина септы составляла 0,5 мкм, ширина – 0,3 мкм.
После проведения идентификации образцы со сред BG-11 и Громов 6 были повторно пересеяны на жидкие среды. По истечению 2 недель наблюдалось активный рост биомассы.
Таким образом, в ходе экспериментальных работ были выделены альгологически чистые культуры нитчатых и одноклеточных цианобактерий, предположительно идентифицированные как Oscillatoria amphibia и Synechocystis sp..
Культуры помещены в коллекцию кафедры «Прикладная биология и микробиология» Астраханского государственного технического университета.
Список литературы
1. Гайсина, Л.А. Современные методы выделения и культивирования водорослей: учебное пособие / Л.А. Гайсина, А.И. Фазлутдинова, Р.Р. Кабиров. – Уфа: БГПУ, 2008.- 152 с.
2. Культивирование коллекционных штаммов водорослей. Межвуз. сб. / Под ред. проф. Б.В. Громов. – Л. – 1983. – 152 с.
3. Методы физиолого-биохимического исследования водорослей в гидробиологической практике / Отв. ред. А.В. Топачевский. – Киев: Наукова думка. – 1975. - 247 с.
4. Определитель бактерий Берджи / Под ред. Дж. Хоулта, Н. Крига, П. Снита, Дж. Стейли, С. Уилльямса // в 2-х т. –1997. – Т. 1. – 432 с.
5. Панкратова, Е. М. Азотфиксирующие ЦБ как основа микробных консорциумов // Автотрофные микроорганизмы: К 75-летию со дня рожд. акад. РАН E.H. Кондратьевой.: Матер. Междунар. научн. конф.– М.: Макс Пресс. – 2000. – С. 140-141.
6. Сопрунова О.Б. Особенности функционирования альго-бактериальных сообществ техногенных экосистем: Дисс….д-ра биол. наук. – М., 2005. – 432 с.
