МОЛЕКУЛЯРНЫЕ СВОЙСТВА ПЕРВОГО КИСЛОРОД-РЕДУКТАЗНОГО НАТРИЕВОГО НАСОСА*

У живых организмов биологически доступная энергия запасается в процессе дыхания в виде трансмембранного градиента протонов на внутренней мембране клеточных органелл митохондрий (у эукариот) или на цитоплазматической мембране (у прокариот). Молекулярные механизмы, которые генерируют градиент протонов на мембранах путем перекачки протонов через мембраны, представлены кислородредуктазными электронтранспортными цепями (КР-ЭТЦ). В общем случае КР-ЭТЦ образованы комплексами I, II, III и IV. Три десятилетия назад у морских алкалифильных бактерий был обнаружен первый натрий (Na+)-перекачивающий механизм на уровне комплекса I в аэробной дыхательной цепи, а именно, Na+-специфичная НАДН-хинон-оксидоредуктаза (NQR) [6]. Высказывалось предположение и о существовании Na+-перекачивающего комплекса IV у алкалифильных бактерий [5]. Однако, в течение последних 30 лет из всех энергопреобразующих комплексов аэробных дыхательных цепей NQR оставался единственным компонентом, для которого была доказана способность запасать энергию в форме трансмембранного градиента Na+. Недавно нашей группой было получено доказательство функционирования в аэробной дыхательной цепи экстремально алкалифильных бактерий первого кислород- редуктазного Na+-насоса, а именно, комплекса IV, представленного цитохром-с оксидазой (ЦО) cbb3-типа [3].

 Исследованные до настоящего времени ЦО входят в суперсемейство оксидаз с гем-медным биядерным каталитическим центром и представлены протон-перекачивающими ферментами, принадлежащими к подсемействам трех типов: A, B и C. Оксидазы С-типа (цитохромы cbb3), широко распространенные среди патогенных бактерий, изучены в наименьшей степени. В частности, несмотря на доступность рентгеновской структуры [1] у фермента до настоящего времени механизм перекачки протона малоизучен. В настоящей статье мы представляем молекулярные свойства первой Na+-перекачивающей ЦО -   цитохрома cbb3 из экстремально алкалифильной бактерии Thioalkalivibrio versutus. Это исследование дает ключ к пониманию прежде неизвестной структуры Na+-перекачивающей ЦО С-типа и позволит в дальнейшем выяснить функциональные свойства этого фермента.

Объект исследований, Tv. versutus, является экстремально гало- и алкалифильной серуокисляющей бактерией из подразделения Gammaproteobacteria. Микроорганизм населяет уникальную экологическую нишу (рН 10-11, соленость до 2 М по натрию) - высокощелочные содовые озера Тувы (Сибирь), из которых объект исследований и был выделен. Мембранные ферменты таких экстремофильных видов зачастую нестабильны и с трудом поддаются выделению. В настоящей работе получены поликлональные кроличьи антитела на 17-членный С-концевой фрагмент главной субъединицы cbb3-оксидазы Tv. versutus. С помощью полученных антител идентифицирован весь комплекс и установлен его субъединичный состав. Также прочитан весь оперон, кодирующий фермент. К настоящему времени не описано ни одного комплекса cbb3- оксидаз из экстремально гало- и алкалифильных бактерий.

Краткая характеристика цитохрома cbb3 из бактерии T. versutus.

 Разностные спектры поглощения изолированных клеточных мембран (восстановление дитионитом натрия- минус-окисление воздухом, и CO восстановление дитионитом натрия-минус-восстановление дитионитом натрия) [3] в совокупности с HPLC анализом гемов клеточных мембран [3] показали, что цитохром cbb3 является основной ЦО у бактерии T. versutus, выращенной в колбочной культуре.

Рис. 2. Определение субъединичного состава Na+-перекачивающей ЦО cbb3-типа Tv. versutus. (А) Вестерн блот после переноса белков, разделенных неденатурирующим электрофорезом в 6% полиакриламидном геле (ПААГ); ECL-иммунодетекция комплекса cbb3 при помощи поликлональных антител специфичных к С-концу каталитической субъединицы (ccoN). (Б) Электрофореграмма после денатурирующего электрофореза в 12% ПААГ. На дорожках: 1 - экстракт мембранных белков Tv. versutus; 2 -     иммунодетекция субъединицы ccoN после денатурирующего электрофореза мембранных белков и блоттинга; 3 - комплекс cbb3, элюированный из зоны на 6% ПААГ, соответствующей иммунодетектируемой зоне на блоте (верхняя красная стрелка на иммуноблоте (А)); 4 - белки-маркеры. Дорожки: 1, 3 и 4 - окраска Кумасси R-250; 2 - ECL-иммунодетекция антителами к С-концу ccoN. На врезке в красной рамке - N- концевая последовательность белка (отмечен нижней красной стрелкой, дорожка 3). Последовательность идентична N-концевому фрагменту субъединицы ccoO в комплексе cbb3 из Tv. versutus, предсказанному по нуклеотидной последовательности соответствующего гена (EMBL accession no. HE575403.1).

 Поликлональные кроличьи антитела, выработанные против 17-членного полипептида, соответствующего С-концу предсказанной каталитической субъединицы (ccoN) cbb3 ЦО, образовывали комплекс  только с одним полипептидом в  ПААГ после неденатурирующего электрофореза (Рис.  1А).

Электрофорез элюата из этой полосы во втором направлении выявил три субъединицы (такой субъединичный состав наиболее часто встречается у cbb3 ЦО) с кажущимися молекулярными массами 48, 34 и 29 кДа (Рис. 1Б, дорожка 3). Применение антител специфичных к С-концу предсказанной субъединицы ccoN позволило идентифицировать полипептид с молекулярной массой 48-кДа, как каталитическую субъединицу (Рис. 1Б, дорожки 2 и 3). Полипептид с молекулярной массой 29-кДа на основании данных расшифровки N-концевой аминокислотной последовательности был идентифицирован как субъединица ccoO (Рис. 1Б, дорожка 3 и врезка в красной рамке). Окраска гелей на гемы с использованием пероксидазной реакции показала, что полипептиды с молекулярными массами 34- и 29-кДа содержат ковалентно-связанные гемы с, как и у ранее описанных cbb3 ЦО. Субъединицы ccoN, ccoO и ccoP - обязательные компоненты комплекса cbb3 у изученных представителей [2]. Таким образом, в нашем исследовании установлено, что Na+-перекачивающая ЦО cbb3-типа из экстремальноалкалифильной бактерии Tv. versutus обладает общей структурой с представителями ЦО С-кластера [4]. Первичная аминокислотная последовательность субъединиц комплекса (предсказана по расшифрованным нами данным нуклеотидной последовательности оперона, EMBL accession no. HE575403.1) имеет высокую гомологию с субъединицами комплекса cbb3 из бактерии P. stutzeri (более 60 %) и содержит все консервативные аминокислотные остатки, которые служат лигандами ключевых простетических групп у ЦО кластера С-типа: двух гемов b, меди CuB, иона кальция и трех гемов с.

Заключение

 

Получены антитела на каталитическую субъединицу оксидазы cbb3-типа из экстремально гало- и алкалифильной бактерии Tv. versutus. С помощью полученных антител доказано, что в бактерии экспрессируется оксидаза cbb3-типа, а также показано, что субъединица с массой 48 кДа является каталитической (ccoN). Расшифрована нуклеотидная последовательность оперона cbb3-оксидазы, которая может быть использована для клонирования этого фермента в другом организме.

 

*Работа поддержана грантами РФФИ № 14-04-01577 (биохимические анализы) и РНФ № 14-50-00029 (анализ баз данных).

 

 

Список литературы

 

 

1.    Buschmann S, Warkentin E, Xie H, Langer JD, Ermler U et al.: The structure of cbb3 cytochrome oxidase provides insights into proton pumping // Science, 2010. - V. 329(5989). - P. 327–330.

2.   Gribaldo S, Talla E, Brochier-Armanet C: Evolution of the haem copper oxidases superfamily: a rooting tale // Trends Biochem Sci, 2009. - V. 34(8). - P. 375–381.

 3. Muntyan MS, Cherepanov DA, Malinen AM, Bloch DA, Sorokin DY, et al.: Cytochrome cbb3 of Thioalkalivibrio  is a Na+-pumping cytochrome oxidase // Proc Nat Acad Sci USA, 2015. - V. 112(25). - P. 7695–7700.

 4.    Myllykallio H, Liebl U: Dual role for cytochrome oxidase in clinically relevant proteobacteria? // Trends Microbiol, 2000. - V. 8(12). - P. 542–543.

5. Skulachev VP: Sodium bioenergetics // TiBS, 1984. - V. 9(11). - P. 483-485.

6.   Tokuda H, Unemoto T: Na+ is translocated at NADH: quinone oxidoreductase segment in the respiratory chain of Vibrio alginolyticus // J Biol Chem, 1984. - V. 259(12). - P. 7785-7790.