12 октября 2015г.
Производные бис-(β-хлорэтил)-амина (циклофосфан, ифосфамид) широко применяются в медицине для лечения целого ряда онколог
ических и аутоиммунных заболеваний. Для них характерна высокая токсичность в отношении теплокровных животных и человека. Для крыс LD50 циклофосфана составляет 200 мг/кг внутрибрюшинно, LD50
ифосфамида – 143 мг/кг перорально. Зафиксированы случаи отравлений данными веществами, в том числе летальных [2, 3].
Широкое применение производных бис-(β-хлорэтил)-амина, их высокая токсичность и наличие случаев летальных отравлений обусловливают необходимость изучения соединений данной группы в химико-токсикологическом отношении.
Анализ литературных данных показал, что до настоящего времени вопросы распределения токсических доз циклофосфана и ифосфамида в организме теплокровных животных изучены недостаточно.
Поэтому целью настоящего исследования явилось изучение особенностей распределения токсических доз отдельных производных бис-(β-хлорэтил)-амина в организме теплокровных животных (крысы).
Материалы и методы исследования
Объекты исследования – субстанции циклофосфана (производитель – ОАО «Компания «Деко», содержание основного вещества не менее 99%) и ифосфамида (производитель – ОАО «Верофарм», содержание основного вещества не менее 99%).
Эксперименты проводили на крысах-самцах массой 210-260 г. Для изучения распределения каждого вещества использовалось 5 экспериментальных групп (по 5 особей в каждой) и одна контрольная (5 особей). Исследуемые вещества вводили внутрижелудочно в виде водной суспензии в дозах, равных тройной LD50: 600 мг/кг и 430 мг/кг циклофосфана и ифосфамида соответственно. Особям контрольных групп в желудок вводили воду очищенную.
После гибели животных их трупы вскрывали, одинаковые органы и биожидкости, взятые от особей внутри каждой группы, объединяли и исследовали на наличие в них циклофосфана или ифосфамида. Параллельно исследовали органы и биожидкости представителей контрольной группы.
Изолирование изучаемых веществ из биоматериала проводили методом двукратного настаивания. Изолирующим агентом являлся ацетон, массовое соотношение «изолирующий агент – биоматериал» – 2:1, продолжительность каждого настаивания – 45 минут. Извлечения, полученные после первого и второго настаивания, объединяли и упаривали в токе воздуха при комнатной температуре.
Очистка извлечений. Сухой остаток, полученный после испарения объединенного извлечения, растворяли в 2 мл элюента гексан-диоксан-пропанол-2 в объемных соотношениях 20:0,5:1 (при исследовании циклофосфана) или 17,5:5:0,75 (при исследовании ифосфамида) и вносили раствор в колонку размерами 120×11 мм, заполненную 10 г силикагеля КСК 40/100 мкм. Через колонку пропускали соответствующую подвижную фазу, а элюат собирали фракциями по 2 мл. Фракции с циклофосфаном (с 7 по 19 включительно) и ифосфамидом (с 6 по 16 включительно) объединяли и упаривали в токе воздуха при комнатной температуре до сухого остатка, который затем растворяли в 10 мл ацетона – «исходный раствор».
Идентификация методом ТСХ. 0,5 мл «исходного раствора» количественно переносили в виде полосы на линию старта хроматографической пластины «Сорбфил» марки ПТСХ-АФ-А-УФ и хроматографировали в присутствии веществ-свидетелей, используя элюент гексан-диоксан-пропанол-2 в объемном соотношении 10:5:1. Хроматограммы проявляли в УФ-свете. Исследуемые вещества идентифицировали по величине Rf.
Идентификация методом электронной спектрофотометрии. После хроматографирования методом ТСХ пятна анализируемых веществ вырезали из пластины, а вещества элюировали из сорбента этанолом двукратно порциями по 5 мл. Элюаты объединяли в выпарительной чашке и испаряли растворитель в токе воздуха при комнатной температуре. Вещества в сухом остатке переводили в соответствующие нитропроизводные, обрабатывая остаток в течение 5 минут 10% раствором нитрата калия в концентрированной серной кислоте. Реакцию среды доводили до щелочных значений рН 10% раствором гидроксида натрия. Светопоглощение водно-щелочных растворов нитропроизводных циклофосфана и ифосфамида исследовали на спектрофотометре СФ-56 в области длин волн 200-400 нм в кварцевых кюветах с толщиной рабочего слоя 10 мм. Определяемые соединения идентифицировали по форме спектральной кривой и положению максимумов поглощения.
Количественное определение. По величине оптической плотности водно-щелочных растворов нитропроизводных, измеренной при длине волны 253,3 нм или 255,2 нм, определяли количественное содержание циклофосфана или ифосфамида соответственно, используя уравнения градуировочных графиков.
Извлечения из органов животных контрольных групп исследовали по аналогичной схеме.
Результаты исследования и их обсуждение
При идентификации анализируемых веществ методом тонкослойной хроматографии циклофосфан и ифосфамид обнаруживаются на хроматограммах в УФ-свете в виде темных пятен на более светлом общем фоне пластины. Величина Rf пятен исследуемых веществ соответствует величине Rf веществ-стандартов (Rfциклофосфана=0,53±0,02; Rfифосфамида=0,58±0,02).
При идентификации методом УФ-спектрофотометрии сравнивали спектральные кривые нитропроизводных циклофосфана и ифосфамида, извлеченных из органов и биожидкостей экспериментальных животных и очищенных по вышеописанной схеме, со спектрами нитропроизводных чистых субстанций. Обнаруживалось совпадение формы спектральной кривой и положения точек экстремумов (253±2 и 366±2 нм для циклофосфана, 255±2 и 363±2 нм для ифосфамида).
При исследовании извлечений из тканей органов крыс, не получавших циклофосфан и ифосфамид, было установлено отсутствие данных соединений в тканях внутренних органов и крови животных контрольной серии.
Уравнения градуировочных графиков для фотометрического определения исследуемых веществ по поглощению их нитропроизводных в УФ-области спектра имеют вид:
для нитропроизводного циклофосфана: А = 0,00895·С – 0,00102;
для нитропроизводного ифосфамида: А = 0,00867·С – 0,00797;
где А – оптическая плотность, С – концентрация анализируемого вещества в фотометрируемом растворе (мкг/мл) [1].
Результаты определения циклофосфана и ифосфамида в органах отравленных животных приведены в Табл.1.
Наибольшие количества циклофосфана обнаруживаются в почках, мочевом пузыре, легких, печени; ифосфамида – в мочевом пузыре, почках, печени.
Таблица 1
Результаты определения производных бис-(β-хлорэтил)-амина в органах и тканях теплокровных животных (крысы)
|
Орган или биожидкость
|
Найдено, мг в 100 г биообъекта
|
|
Циклофосфан
|
Ифосфамид
|
|
|
S
|
S
|
|
|
S
|
S
|
|
|
Кровь
|
49,80
|
2,52
|
1,13
|
3,13
|
34,24
|
3,23
|
1,44
|
4,02
|
|
Сердце
|
55,86
|
2,92
|
1,31
|
3,63
|
33,61
|
2,73
|
1,22
|
3,39
|
|
Легкие
|
92,01
|
5,24
|
2,34
|
6,52
|
25,40
|
2,51
|
1,12
|
3,12
|
|
Печень
|
91,47
|
4,94
|
2,21
|
6,14
|
39,45
|
3,16
|
1,41
|
3,93
|
|
Почки
|
104,77
|
5,08
|
2,27
|
6,32
|
40,91
|
2,66
|
1,19
|
3,31
|
|
Селезенка
|
67,50
|
3,28
|
1,47
|
4,08
|
32,25
|
3,02
|
1,35
|
3,76
|
|
Мочевой пузырь
|
92,25
|
4,99
|
2,23
|
6,20
|
43,77
|
2,68
|
1,20
|
3,33
|
Выводы
1. Изучено распределение циклофосфана и иф
осфамида в организме теплокровных животных (крысы) при однократном внутрижелудочном введении тройных доз LD50.
2. Установлено, что анализируемые соединения в значительных количествах обнаруживаются в почках, мочевом пузыре, легких, печени (циклофосфан), мочевом пузыре, почках, печени (ифосфамид).
Список литературы
1. Шорманов, В.К. Спектрофотометрическое определение циклофосфана и ифосфамида на основе получения их нитропроизводных / В.К. Шорманов, М.Л. Столяров // Научные ведомости БелГУ. Серия Медицина. Фармация. – 2014. – № 11 (182). – С. 256-259.
2. Imtiaz, S. Ifosfamide neurotoxicty in a young female with a remarkable response to thiamine / S. Imtiaz, N. Muzaffar // J. Pak. Med. Assoc. – 2010. – Vol. 60, N 10. – Р. 867-869.
3. King, P.D. Hepatotoxicity of chemotherapy / P. D. King, M. C. Perry // Oncologist. – 2001. – Vol. 6, № 2. – Р. 162-176.
