ИЗОЛИРОВАНИЕ И ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЗОЛПИДЕМА В ТКАНИ ПЕЧЕНИ

Золпидем является представителем снотворных лекарственных средств третьего поколения, применяется в медицинской практике для лечения инсомний. Препарат обладает токсичностью. Описаны случаи интоксикаций золпидемом, в том числе со смертельным исходом. Для установления факта отравления необходимо определение золпидема в биологических объектах. Методики химико-токсикологического анализа золпидема в настоящее время разработаны недостаточно. Поэтому целью настоящей работы является определение золпидема в трупной ткани печени, а также установление предела определения и линейности.

Для выполнения поставленной цели мы использовали методику, разработанную ранее Карташовым В.А. с соавт. [1].

По 5,0 г тщательно измельченной ткани печени помещали в шесть пенициллиновых флаконов вместимостью 20 мл, в пять из которых добавляли по 1 мл водного раствора золпидема тартрата, содержащего 200 мкг в 1 мл, в шестой флакон помещали 1 мл воды. Содержимое флаконов перемешивали на аппарате для встряхивания в течение 2-х часов. В каждый флакон добавляли по 10,0 мл ацетона, экстрагировали в течение 10 минут, центрифугировали 5 мин при 3000 об/мин (I ступень).  Экстракты отделяли и процедуру экстрагирования повторяли ещё раз с использованием 5,0 мл ацетона (II ступень). Ацетоновые экстракты, полученные на каждой ступени процеживали через небольшие ватные тампоны в сухие пенициллиновые флаконы и выпаривали при 40^о С на водяной бане под слабым током воздуха до полного удаления ацетона. Содержимое флаконов смешивали с 5,0 мл 0,1 н. раствора соляной кислоты (рН 2), добавляли 5 мл н-гексана и экстрагировали в течение 5 мин. Органическую фазу отделяли центрифугированием и не исследовали, а водную - подщелачивали 25 % раствором гидроксида аммония до рН 9 и экстрагировали 5 мл хлороформа в течение 5 мин. Хлороформные экстракты отделяли, и экстракцию хлороформом повторяли еще один раз. Объединенные экстракты фильтровали через сухой бумажный фильтр в присутствии безводного сульфата натрия и выпаривали досуха при 40°С под слабым током воздуха. Сухие остатки с помощью нескольких капель хлороформа количественно наносили на стартовую линию пластины «Sorbfil» 100·150 см с флюоресцирующей добавкой в виде полосы, с одной стороны которой наносили смесь метчиков, с другой – стандартный раствор золпидема. Хроматографирование проводили в системе ацетон без предварительного насыщения камеры парами растворителя. Полученные хроматограммы обрабатывали реактивом Драгендорфа, зону окрашенную в оранжевый цвет, расположенную в V хроматогрофической группе на уровне стандарта (Рисунок 1), счищали в пенициллиновые флаконы.

Рис.1. Хроматограмма, полученная при исследовании     золпидема: 1 - точка нанесения смеси метчиков; 1^/  - точка нанесения стандарта , 2 и 2^/- стартовая и обнаруженная полосы золпидема соответственно.

Во флаконы добавляли по 5,0 мл 0,1 н. раствора щелочи и 5 мл хлороформа и экстрагировали в течение 5 мин и полученную смесь центрифугировали при 2000 об/мин в течение 5 мин.  Хлороформные экстракты отделяли, фильтровали через сухой бумажный фильтр в присутствии безводного сульфата натрия и выпаривали досуха при 40^о С на водяной бане под слабым током воздуха. Сухие остатки растворяли в 10 мл спирта и спектрофотометрирова

ли в диапазоне 200-400 нм по сравнению с раствором, полученным при исследовании холостой пробы, измеряя величины оптических плотностей в  максимуме поглощения спиртового раствора основания золпидема (при 243 нм). Данные спектрофотометрического анализа приведены на Рисунке 2, и в Табл.1.

Рис.2. Спектр абсорбции золпидема, выделенного из ткани печени (n=5): I, II –ступени экстракции.

Таблица 1

Выход золпидема при экстрагировании из ткани печени (n=5), λ_max = 243 нм.

٭Примечание: Молекулярная масса золпидема тартрата – 764,88, основания – 616,88.

Как видно из полученных данных (Рисунок 2.,Табл.1), золпидем экстрагируется из ткани печени за две ступени и определяется УФ-спектрофотометрическим методом в среднем в количестве 76%.

Установление предела обнаружения и линейности золпидема при экстрагировании его из ткани печени

Для установления минимального количества золпидема, которое может быть выделено из ткани трупной печени по вышеизложенной методике и определения линейности, были выполнены следующие эксперименты.

Экстрагирование золпидема из 5,0 г измельченной ткани печени, содержащей 200, 100, 50, 25, 10, 5, и 2,5 мкг золпидема тартрата, проводили, как выше описано, выполняя по 5 параллельных определений и одному холостому для каждой концентрации. Результаты приведены в Табл.3, и на Рисунке 3, которые показывают, что предел определения  золпидема по  приведенной методике составляет 5 мкг в 5 г печени. При этом линейность золпидема лежит в пределах 5 – 100 мкг (Рисунок 4).

Таблица 3

Данные по экстрагированию из ткани печени разных количеств золпидема (n=5)

Рис.4. График зависимости величины оптической плотности от концентрации золпидема

Таким образом при использовании методики, основанной на применении ацетона в качестве экстрагента, вариантов экстракционной и хроматографической очистки, золпидем определяется в достаточно больших количествах независимо от его содержания в образцах. Установленный предел определения золпидема при экстрагировании из ткани печени свидетельствует о высокой чувствительности описанной методики.

Список литературы

1.     Карташов В.А., Чернова Л.В. Химико-токсикологический анализ. Ч. 1: Выделение токсических веществ из биологических объектов. Майкоп: Качество, 2008. 188 с.