11 января 2016г.
Микро- и нанообъекты представляют собой практический и научно-исследовательский интерес, как для фармацевтической биотехнологии, так и для медицины. Особый интерес представляют биополимеры микробного происхождения, которые участвуют во многих процессах жизнедеятельности клетки, выполняют функцию капсулы и увеличивают потенциальную вирулентность микроорганизма.
Специфические особенности и функционирование биополимеров привлекают внимание исследователей самых разных направлений и определяются, с одной стороны, биопленкообразующей активностью микроорганизмов, а с другой стороны, устойчивостью к повреждающим факторам среды.
Эксперименты в области биополимеров показывают зависимость биологических и физиологических свойств биообъекта от разнообразных факторов среды, предполагающих модификационную изменчивость микроорганизмов, которую можно использовать для различных целей биотехнологии.
Использование нанотехнологии в биологии и медицине базируется на знании уникальных физических и химических свойств наноматериалов.
Наноматериаловедение уже сегодня готово предоставить в распоряжение биологии и медицины широкий спектр наночастиц, различных по своим физико-химическим и биологическим свойствам. Подробные наномедицинские исследования позволят определить, какие из наноматериалов являются оптимальными платформами для создания диагностических и терапевтических средств.
Активное внедрение наноматериалов в клиническую медицину требует глубокого знания потенциальных рисков и побочных эффектов, сопряженных с использованием этих материалов. Производственные циклы, направленные на создание новых наноматериалов, также могут сопровождаться накоплением отхо дов, оказывающих токсическое, канцерогенное и мутагенное действие на организм человека. В связи с этим, в специальной литературе последних лет большое внимание уделяется рассмотрению вопросов безопасности наноматериалов и нанотехнологии в медицине и биологии .
В настоящее время достаточно хорошо охарактеризованы такие наноматериалы, как нанопористые мембраны, нанотрубки, разнообразные типы наночастиц, а также нанодисперсии (коллоиды) и нанокристаллы. Необ ходимо отметить невероятное множество применений описанным выше наноматериалам. Так, область применения нанопористых материалов простирается от трансплантации иммуноизолированных клеток до сверхс коростного секвенирования ДНК.
Углеродные нанотрубки, в свою очередь, представляют собой цилиндрические структуры, образованные листками графита, и сочетающие в себе высокую жесткость и упругость со способностью к обратимому сгибанию и коллабированию. Их можно использовать в качестве носителей лекарственных веществ. Известно, что нанотрубки взаимодействуют с макромолекулами (ДНК, белки), а функционализированные нанотрубки могут служить переносчиками как небольших молекул лекарственных веществ, так и макромолекулярных комплексов.
Нанодисперсии же являются удобными транспортными средствами для пло хорас творимых амфифильных и липофильных веществ. Гидрофильные нанодисперсии обладают очень важным свойством: они очень быстро проникают в клетки.
Таким образом, применение наноматериалов в медицине не ограничивается решением изолированных узких задач. Проводимые исследования отражают общую тенденцию к созданию многофункциональных устройств, сочетающих в себе диагностические и терапевтические возможности. В то же время, наномедицина идет по пути профилизации и специализации, проникая в такие отрасли медицинской науки, как офтальмология, стоматология, травматология и ортопедия.
Анализ исследований в области фармацевтической биоте хноло гии показал, что изучение биополимеров микробного происхождения требует комплексного подхода: применение технологии иммобилизации биообъекта, современных экспериментальных методов, например, методов цифровой люминисцентной микроскопии. Подобный подхо д демонстрируется в настоящей работе.
Целью данной работы являлось исследование взаимосвязи структуры и ф ункциональных свойств биополимеров Pseudomonas alcaligens с использованием экспериментального исследования поверхности ансамблей биопленок псевдомонад.
Для достижения поставленной цели выдвинуты следующие задачи:
1.Анализ современного состояния исследований в области биополимеров микробного происхождения; 2. Анализ взаимосвязи «структура-функциональные свойства полиса харидны х биополимеров»; 3. Отработка методик визуализации объектов для экспериментального исследования; 4. Проведение экспериментального исследования повер хнос ти ансамбля нанокомплексов на примере полиса харидного матрикса Pseudomonas alcaligens.
Методы исследования
Активность образования биопленки (А БО) определяли колориметрическим методом с использованием красителя кристаллического фиолетового. Подвижность «роения» (swarming motility) определяют в 0.5% агаризованной минеральной среде следующего состава: 5.5 г Na2HP04, 3.0 г КН2Р04, 0.5 г Na Cl, 5 г агара, 2 г глюкозы, 0.5 г гистидина в 1 л дистиллированной воды с 2 мМ MgS04, 1 мМ тиамина, 0.1 мМ Са С12.
Активность образования полиса харидны х матриксов клетками Pseudomonas alcaligens оценивалась в динамике – через 4, 8, 24 часов и через 8 суток. При изучении ультраструктуры клеток в составе ассоциаций выявлено доминирование грамотрицательных форм, способных к капсулообразованию. По результатам цифрового микроскопирования после 4х часов эксперимента в большинстве проб наблюдалось наличие отдельных клеток, после 8 часов - отдельных клеток с тенденцией к объединению в группы, после 24 часов эксперимента - четко оформленных островков биопленкообразователей, с выраженным полиса харидным матриксом и плотной агрегацией клеток, после 8 суток – разрушенные островки без полиса харидного матрикса, с отдельными, более плотными, скоплениями клеток, остальная часть клеток в поле зрения оказалась рассеяна более свободно. Во всех вариантах эксперимента установлено наличие гетерогенности АБО у изучаемых микроорганизмов, которая выражалась в агрегировании клеток в группы и, затем, в островки уже после 4-х часов эксперимента. Подобные данные позволяют судить о фенотипической изменчивости Pseudomonas alcaligens по отношению к АБО, что требует дальнейшей стабилизации полисахаридных комплексов методами иммобилизации полимерами заданной структуры.
Так же, при исследовании было установлено ингибирующее действие Pseudomonas alcaligenes в отношении патогенных микроорганизмов, таких как Staphylococcus aureus и Aeromonas sp. Однако продукция противомикробных веществ активными культурами Pseudomonas alcaligenes происходила только пр и их культивировании с чувствительным штаммом.
Анализ полученных результатов экспериментов позволяет заключить следующее: рассматриваемые штаммы Pseudomonas alcaligens обладают способностью к синтезу внеклеточных полиса харидов, которые формируют агрегаты разной степени устойчивости к антибиотикам, антимикробным средствам и реакции организма хозяина.
Необ ходимо отметить, что повышенную устойчивость к вредным факторам также обеспечивает присущее штамму фенотипическое разнообразие, которое позволяет им переносить большинство неблагоприятных воздействий. Благодаря таким ме ханизмам защиты от пагубных факторов, образуемые ансамбли биопленок псевдомонад могут найти широкое применение в практической медицине.
Установленный феномен требует дальнейшего изучения с целью модификации и дальнейшего использования в медицинских целях.
