ИЗУЧЕНИЕ СОХРАНЯЕМОСТИ 2-МЕТОКСИ-4-АЛЛИЛГИДРОКСИБЕНЗОЛА В БИОЛОГИЧЕСКОМ МАТЕРИАЛЕ

2-Метокси-4-аллилгидроксибензол (в дальнейшем 2-МО-4-АГОБ) – биологически активное вещество, проявляющее свойства антисептика и антиоксиданта. 2-МО-4-АГОБ получают как синтетическим путём, так и из природных источников (эфирные масла гвоздичного дерева, базилика и ряда других растений). Данное вещество достаточно широко применяется в стоматологической практике.

Химическая формула 2-МО-4-АГОБ имеет вид:

Многие гидроксипроизводные ароматического ряда, в том числе 2-МО-4-АГОБ, токсичны для теплокровных [5, 6].

LD50 2-МО-4-АГОБ для крыс при введении в желудок составляет 1930 мг/кг. Описаны случаи летального отравления людей данным веществом [1, 7].

Несмотря на широкое применение 2-МО-4-АГОБ и его токсические свойства, в судебно-химическом отношении рассматриваемое соединение изучено недостаточно. Продолжает оставаться не вполне изученными вопросы устойчивости 2-МО-4-АГОБ в гнилостно разлагающемся биологическом материале.

Цель настоящей работы - изучение сохраняемости 2-МО-4-АГОБ в гнилостно разлагающемся биологическом (трупном) материале.

Материалы и методы исследования. 

Объектом исследования явился 2-метокси-4-аллилгидроксибензол (2-МО-4-АГОБ) фирмы «Мерк», содержание вещества ≥99%.

Изучение сохраняемости 2-МО-4-АГОБ осуществляли в четырёх температурных режимах: при 0-2оС, 8-10оС, 20-22оС и 36оС. В процессе исследования в 4 склянки из тёмного стекла (вместимостью 200 мл каждая) вносили по 60 г мелкоизмельченной ткани печени и прибавляли отравляющее вещество из расчёта 0,1 г на 100 г биологического материала.

Ткань печени и анализируемое вещество тщательно перемешивали, Каждую из полученных искусственных смесей сохраняли в одном из температурных режимов, указанных выше. В подобных же условиях сохраняли контрольные образцы печени. Сохраняемые искусственные смеси исследовали на содержание 2-МО-4-АГОБ через 1,5 часа после их приготовления и далее через определенные равные промежутки времени.

Для исследования в каждом случае брали по 5 г искусственной смеси, содержащей анализируемое соединение, или такое же количество контрольного образца печени и настаивали с 10 мл этилацетата в течение 45 минут при периодическом перемешивании. Жидкое извлечение отделяли от твердого остатка декантацией. Операцию настаивания повторяли. Отдельные извлечения объединяли, фильтровали через стеклянный фильтр диаметром 4 см со слоем безводного сульфата натрия толщиной 1 см. Слой сульфата натрия промывали 10 мл этилацетата. Фильтраты объединяли, упаривали до объема 3-4 мл и доводили этилацетатом до 5 мл (исходный этилацетатный раствор).

Определение методом ТСХ. На три хроматографические пластины «Силуфол UV- 254» наносили по 0,1-0,3 мл исходного раствора и хроматографировали в присутствии вещества-свидетеля (подвижная фаза –гексан-диэтиловый эфир (6:4), способ проявления – облучение УФ-светом).

Определение методом УФ-спектрофотометрии. После хроматографирования методом ТСХ по схеме, описанной выше, участок пластины с пятном анализируемого вещества вырезали, помещали в пробирку и элюировали этанолом в течение 15 минут. Исследовали особенности поглощения этанольного элюата в интервале длин волн 190-360 нм, регистрируя оптическую плотность через каждые 5 нм на спектрофотометре СФ-46 в кюветах с длиной оптического пути 10 мм на фоне контрольного раствора. По результатам измерений строили спектральную кривую, отражающую зависимость оптической плотности от длины волны.

Определение методом ВЭЖХ. После хроматографирования методом ТСХ по схеме, описанной выше, участок хроматограммы с пятном анализируемого вещества вырезали и элюировали вещество из сорбента 5 мл ацетона. Элюат отделяли, растворитель испаряли в токе азота. Остаток растворяли в 1-2 мл смеси гексан-диоксан-пропанол-2 (15:5:1). 2-16 мкл вводили в колонку размерами 64×2 мм, заполненную сорбентом «Силасорб-600». Хроматографировали на приборе «Милихром» с УФ-детектором. Подвижная фаза – гексан-диоксан-пропанол-2  (15:5:1),  скорость  её  подачи  –  100  мкл/мин,  скорость диаграммной ленты – 720 мл/час, масштаб регистрации – 0,8 ед.о.п., время измерения – 0,6 сек. Оптическую плотность измеряли при 280 нм. Параллельно в этих же условиях хроматографировали вещество – свидетель.

Определение на основе реакции с диазотированным 2-(4- аминобензолсульфамидо)- тиазолом. После хроматографирования методом ТСХ по схеме, описанной выше, участок хроматограммы с пятном анализируемого вещества вырезали и элюировали вещество из сорбента 5 мл этанола. Этанольный элюат отделяли и при необходимости упаривали до 1- 2 мл. 0,2-0,5 мл элюата вносили в мерную колбу вместимостью 10 мл, доводили до 0,5 мл этанолом, прибавляли 0,5 мл 10% раствора гидроксида аммония и 1 мл 0,1% раствора диазотированного 2-(4-аминобензолсульфамидо)-тиазола. Общий объём содержимого колбы доводили до метки водой. Окраску образующегося раствора сравнивали с окраской раствора, получаемого в контрольном опыте.

Результаты и их обсуждение.

 Проводя идентификацию методом ТСХ, анализируемое вещество обнаруживали в виде темных пятен на более светлом общем фоне пластины и идентифицировали по совпадению значения Rf с таковым вещества-свидетеля (0,53±0,02).

В результате проведения спектрофотометрических исследований в УФ-области анализируемое вещество идентифицировали по форме спектральной кривой и положению точек максимумов полос поглощения, совпадающих с положением максимумов в спектре вещества-стандарта.

По величине оптической плотности, измеренной при длине волны 281 нм, рассчитывали количественное содержание 2-МО-4-АГОБ, используя уравнение градуировочного графика. Полученные результаты пересчитывали на определенную навеску биологического материала.

При определении методом ВЭЖХ анализируемое вещество идентифицировали по времени (объёму) удерживания, совпадающему с временем (объёмом) удерживания вещества – свидетеля.

При идентификации на основе хромогенной реакции с диазотированным 2-(4- аминобензолсульфамидо)-тиазолом появление красной окраски испытуемого раствора свидетельствовало о наличии эвгенола.

В электронном спектре окрашенного продукта, в интервале длин волн 340-560 нм, в случае присутствия 2-МО-4-АГОБ обнаруживалась длинноволновая полоса поглощения с максимумом в области 520 нм.

1 – 0-2оС; 2 – 8-10оС; 3 – 20-22оС; 4 – 36оС.

 Как свидетельствуют полученные данные, при сохранении модельных смесей в выбранных температурных режимах, рассматриваемое вещество может быть определенно в трупном материале по крайней мере в течение 9 месяцев с момента начала эксперимента.

Выводы.

1.     На примере модельных смесей с тканью трупной печени человека изучена сохраняемость 2-метокси-4-аллилгидроксибензола в гнилостно разлагающемся биологическом материале при четырёх различных температурах.

2.       Установлено,  что  в  условиях  сохранения  модельных  смесей  при  0-2оС  рассматриваемое соединение определяется в биологическом материале в течение 8 месяцев, при 8-10оС –  в течение 7,5 месяцев, при 20-22оС – в течение 7 месяцев, при 36оС – в течение 6 месяцев.

Список литературы

1.      Доброриз А.М., Борисенко А.Н., Клиза В.В. Случай смерти от отравления эвгенолом // Судебно-медицинская экспертиза. – 2004. – Т. 47, № 5. – С. 45-46.

2.      Краткая химическая энциклопедия / Под ред. И.Л. Кнунянца. Т. 5. – М.:Советская энциклопедия, 1967. – 1184 с.

 3.      Определение 2-метокси-4-аллилгидроксибензола в биологических объектах при изолировании путём перевода в парогазовую фазу / Шорманов В.К., Асташкина А.П., Саломатин В.Е. и др. // Фармация. – 2012. – Т. 61, № 7. – С. 39-43.

4.      Определение 2-метокси-4-аллилгидроксибензола при химико- токсикологическом исследовании биологического материала / Асташкина А.П., Шорманов В.К., Киричёк А.В. и др. // Судебно-медицинская экспертиза. – 2012.– Т. 55, № 6. – С. 42-45.

 5.      Особенности распределения 4-метоксигидроксибензола в организме теплокровных животных (крысы) при летальных отравлениях / Шорманов В.К., Останин М.А., Асташкина А.П. и др. // Судебно-медицинская экспертиза.  – 2016. –   Т. 59, № 4. – С. 48-53.

6.      Распределение гидроксибензола и 4-метилгидроксибензола в организме теплокровных  животных  при  летальных  отравлениях  /  Асташкина  А.П., Пугачёва О.И., Шорманов В.К. и др. // Фармация. – 2016. – Т. 65, № 1. – С. 35- 38.

7.      Du Plooy W.J. Swart L., van Huysteen G.W. Poisoning with Boophane disticha: a forensic case // Hum. Exp. Toxicol. – 2001. – Vol. 20, № 5. – P. 277-278.