27 марта 2016г.
В современных биомедицинских исследованиях большое внимание уделяется поиску новых путей ранней диагностики и терапии онкологических заболеваний, причем особое внимание уделяется повышению малоинвазивности и высокой адресности воздействия на раковые клетки. Одним из перспективных направлений является использование ДНК-аптамеров.
ДНК-аптамеры (аптамеры, синтетические олигонуклеотиды) –– короткие синтетические одноцепочечные РНК или ДНК, которые благодаря уникальной трехмерной конформации способны с высокой степенью аффинности и селективности связываться с функциональными группами своих биологических мишеней и представляют собой функциональные аналоги белковых антител, обладающие рядом преимуществ. Аптамеры имеют относительно невысокую стоимость, они слабоиммуногенны, стабильны и за счет специфического связывания со своими молекулярными мишенями способны идентифицировать их с высокой степенью чувствительности. [1]. К тому же аптамеры можно химически модифицировать, благодаря чему они приобретают новые свойства, позволяющие использовать их в качестве основы для ранней диагностики и терапии злокачественных образований.
Обычно для диагностики с помощью аптамеров используются проточная цитометрия и электрохимия, но в последнее время идет разработка новых методик диагностики, связанных с применением различных оптических методов. В частности, метод спектроскопии кругового дихроизма (КД) является мощным оптическим инструментом для исследования биологических сред. В основе метода лежит измерение разности поглощения право- и лево- циркулярно поляризованного света при прохождении через оптически активную хиральную среду [2]. Метод позволяет определять конформацию и конфигурацию органических молекул, белков и полипептидов, [3], изменения во вторичной структуре белков, полипептидов, а также исследовать конформации олигонуклеотидов (в частности, ДНК-аптамеров) и олигопептидов [4].
Преимуществом спектроскопии кругового дихроизма является возможность детекции процесса специфического связывания при низкой концентрации олигонуклеотидов в биологической пробе (до 20 мкг/мл) [5], он не требует значительных материальных и технических затрат, позволяет использовать многокомпонентные среды и различные биологические агенты для исследования конформации аптамеров, одинаково чувствителен как к длинным ДНК-цепочкам, содержащим до 8000 нуклеотидов, так и к коротким (до 80 нуклеотидов).
Целью настоящей работы является исследование методами спектроскопии кругового дихроизма специфического связывания ДНК-аптамеров с онкологическими клетками на примере асцитной карциномы Эрлиха.
Измерения в диапазоне от 200 до 650 нм проводились на портативном полифункциональном дихрометре СКД-2МУФ с использованием стандартной кюветы , имеющей оптическую длину пути 1 см, оптическое разрешение 1 нм, точность измерения КД ̴ 10-5. Для измерений использовались коллоидные растворы биофункциональных комплексов, состоящих из золотых наночастиц диаметром 10 нм, модифицированных аптамерами, и модельные асцитные клетки карциномы Эрлиха в водно-солевом растворе (PBS).
На Рисунке 1 представлены спектры кругового дихроизма биологических сред, содержащих (1) – биофункциональные комплексы, (2) – биофункциональные комплексы после связывания с асцитными клетками. Связывание клеток мишени с комплексами аптамеры-наночастицы может приводить к образованию агрегирующих крупных ассоциатов, которые могут седиментировать, тем самым уменьшая объемную концентрацию клеток в исходном растворе, что сопровождается снижением оптического поглощения.
Спектры кругового дихроизма биофункциональных комплексов ((1) на Рисунке 1.) характеризуются тремя достаточно широкими отрицательными пиками в районе 220, 300 и 500 нм. В то время как наличие в растворах асцитных клеток приводит к сдвигу пика в районе 230 нм и практически исчезновению пика в районе 300 нм. Именно это изменение почти в 6 раз интенсивности в районе 300 нм может служить меткой на присутствие в биологических растворах асцитных клеток, аналогичную информацию может, конечно, дать и сдвиг пика в район 230 нм, но технически далеко не все приборы могут работать в этом диапазоне.
Рис.1. Спектры кругового дихроизма растворов: (1) – биофункциональные комплексы, (2) – биофункциональные комплексы, после связывания с асцитными клетками.
Таким образом, метод кругового дихроизма позволяет обнаружить изменение спектра биофункциональных нанокомплексов на основе сферических наночастиц золота, функционализированных ДНК-аптамерами при изменении их конформации, связанной с присоединением к ним асцитных клеток. Это дает возможность использовать его в качестве высокочувствительного оптического инструмента для диагностики онкологических заболеваний.
Работа выполнена при финансовой поддержке Министерства образования и науки (Соглашение № 14.607.21.0104).
Список литературы
1. Zamay G.S., Kolovskaya O.S., Zamay T.N., Glazyrin Y.E., Krat A.V., Zubkova O., Spivak E., Wehbe M., Gargaun A., Muharemagic D., Komarova M., Grigorieva V., Savchenko A., Modestov A.A., Berezovski M.V., Zamay A.S. Molecular Therapy accepted article preview online 10 June 2015; doi:10.1038/mt.2015.108
2. Woody, R.W. Circular dichroism. Meth. Enzymology 1995, 246, 34–71.
3. A. Fischbeck, N. Bartke and H.-U. Humpf New Applications of the CD Exciton Chirality Method. Stereochemical Assignment of Organic Compounds Containing Carboxylic Acid Groups // Monatshefte fur Chemie, V.136, 2005, pp. 397–410.
4. Z. Xiaoyan, C. Enhua, S. Xueguang & B.Chunli Circular dichroism spectroscopic studies on structures formed by telomeric DNA sequences in vitro // Chinese Science Bulletin, V.45, N.21, 2000, pp. 1959-1963
5. Y.-M. Chang, Cammy K.-M. Chen and M.-H. Hou. Conformational Changes in DNA upon Ligand Binding Monitored by Circular Dichroism // Int. J. Mol. Sci., V. 13, 2012, pp. 3394-3413
