27 марта 2016г.
Боковой амиотрофический склероз (БАС) – одно из самых тяжелых нейродегенеративных заболеваний, характеризуется поражением двигательных нейронов (Skvortsova et al. 2011). Эффективные методы терапии отсутствуют. На сегодняшний день единственным рекомендованным больным с БАС препаратом является Рилузол, который увеличивает продолжительность жизни на 10% (Orrell 2010).
В связи с отсутствием эффективных методов терапии БАС представляется актуальным поиск лекарственных препаратов, способных остановить стремительный прогресс данного нейродегенеративного процесса. Одним из перспективных препаратов для терапии нейродегенеративных заболеваний является Димебон. Был получен ряд доказательств, что данное соединение способно оказывать влияние на прогрессию некоторых нейродегенеративных процессов. Так при скрининге ряда соединений, потенциально способных, оказывать нейрогенное и нейропротекторное воздействия, было показано, что Димебон активирует у мышей нейрогенез в области гиппокампа (Pieper et al. 2010), усиливает экскрецию токсических продуктов агрегации белка β-амилойда in vivo и in vitro (Steele et al. 2009), а так же ингибирует образование белковых детергент – нерастворимых агрегатов белка TDP-43 в клеточных культурах (Yamashita et al. 2009). При администрировании Димебона трансгенным мышам Thy1mγSN с оверэкспрессией гамма-синуклеина, показано достоверное снижение уровня цитоплазматических депозитов в мотонейронах передних рогов спинного мозга, уровня астроглиоза, а также достоверное увеличение длительности жизни трансгенных животных (Bachurin et al. 2012). При испытании действия препарата на животной модели болезни Альцгеймера – трансгенных мышах Taup301s, в тканях нервной
системы, которых накапливалась мутантная гиперфосфорилированная форма белка Тау, Димебон способствовал уменьшению его аккумуляции, замедлял прогрессию двигательных нарушений, увеличивал сроки жизни, а также содействовал улучшению некоторых когнитивных функций (Peters et al. 2013). Вышеописанные и другие факты говорят в пользу того, что препарат Димебон является перспективным для терапии заболеваний обусловленных различного рода протеинопатиями (С.О.Бачурин, A.A. Устюгов, O. Петерс, T.A. Шелковникова, В.Л. Бухман 2009), в том числе и БАС.
Для доказательства эффективности препарата Димебон в терапии БАС необходима разработка адекватных генетических моделей, воспроизводящих основные биохимические и патоморфологические характеристики заболевания. Исследования последних лет показали, что в патогенезе многих форм БАС важная роль принадлежит РНК-связывающим белкам, мутантные формы которых способны к необратимой агрегации (Skvortsova et al. 2011; Blokhuis et al.; Ling et al. 2013). На сегодняшний день существует множество трансгенных моделей, однако все они обладают лишь некоторыми фенотипическими признаками данного заболевания и не воспроизводят многих патологических черт, например, таких как селективная гибель мотонейронов (Bachurin et al. 2013).
При исследовании механизмов протеинопатий, ассоциированных с БАС, был описан новый тип молекулярно-клеточной патологии, обусловленный нарушением функции ДНК/РНК-связывающих белков TDP43 и FUS, результатом которой является образование устойчивых структур, не содержащих РНК, в которых депонированы агрегированные формы белков TDP43 и FUS. Этот процесс сопровождается изменением внутриклеточной компартментализации TDP43 и FUS и накоплением их в цитоплазме в составе патогенных включений (Shelkovnikova 2013; T. A. Shelkovnikova et al. 2014; Shelkovnikova, Robinson, et al. 2013; Tatyana A Shelkovnikova et al. 2014).
В данном исследовании была использована трансгенная модель БАС, основанная на фусопатии. У трансгенных мышей данной линии (mutFUS-19), в нервной системе экспрессируется укороченная (∆1-359) форма белка FUS человека, в результате формируются патогистологические включения подобные структурам, обнаруживаемым в аутопсийном материале больных БАС, и развивается неврологический фенотип, соответствующий основным клиническим характеристикам заболевания (Shelkovnikova, Peters, et al. 2013; Deikin et al. 2014). Влияние Димебона исследовали на двух стадиях модельного заболевания: на ранней (пресимптоматической) фазе с началом приѐма препарата на 35-й день после рождения и на близкой к симптоматической стадии, когда в нервной системе трансгенных мышей уже выявляются FUS-реактивные патогистологические включения (63-й день после рождения). Животные получали препарат с питьевой водой ad libitum, контрольная группа препарат не получала. Мышей контрольной и экспериментальных групп содержали в одинаковых условиях (12-часовой дневной/ночной цикл). Работы с животными проводили в соответствии с
―Правилами лабораторной практики в Российской Федерации‖ от 2003 г.
Статистически достоверное увеличение средней продолжительности жизни (СПЖ) мышей, получавших препарат в дозе 11 мг/кг веса, было отмечено в обеих экспериментальных группах. Так, СПЖ мышей, начинавших получать препарат в возрасте 35 дней (n = 18), составила 143 ± 13 сут, что приблизительно на 29% выше, чем у животных контрольной группы (n = 40). Таким образом, хроническое применение Димебона, начатое на ранних пресимптоматических стадиях модельной фусопатии, обеспечивает увеличение СПЖ трансгенных животных (p = 0.012). Более того, схожий эффект Димебона был выявлен и у группы мышей, получавших препарат в позднем периоде пресимптоматической фазы модельного заболевания, то есть непосредственно перед началом манифестации первых клинических признаков нейродегенеративного процесса. В этой группе при использовании препарата в дозе 11 мг/кг веса (n = 27) СПЖ увеличивалась в среднем на 20% по сравнению с контролем (р = 0.047, Рисунок 1Б). Такая же доза (в пересчете на человека) была наиболее эффективной в клинических испытаниях Димебона для пациентов с болезнью Альцгеймера (Doody et al. 2008). При этом в группах, получавших препарат в низкой (5 мг/кг) и высокой (70 мг/кг) дозах статистически значимого эффекта на продолжительность жизни трансгенных животных не наблюдалось (p=0,098, и p=0,14 соответственно).
Полученные результаты свидетельствуют о том, что Димебон способен замедлять прогрессию нейродегенеративного процесса при фусопатии, и эффективность его была наибольшей, когда препарат начинали применять уже на ранних этапах пресимптоматической стадии болезни. Эти данные согласуются с результатами, полученными при исследовании другого типа протеинопатии, где также отмечается селективная потеря двигательных нейронов, но с участием белка гамма-синуклеина. Димебон в этом случае также ингибировал прогрессию нейродегенерации как на ранней пресимптоматической, так и на поздней симптоматической стадиях модельного заболевания (Bachurin et al. 2012; С.О. Бачурин, A.A. Устюгов, O. Петерс, T.A. Шелковникова, В.Л. Бухман 2009).
Вторым важным показателем эффективности применения Димебона при фусопатии является выявленный нами более поздний дебют манифестации клинических симптомов нейродегенеративного процесса (рис. 1В). В группе трансгенных животных, получавших препарат, начиная с 63-го дня, средний возраст дебюта модельного заболевания составлял 126 ± 7 дней, что на 22% позже, чем в контрольной группе (р = 0.023, рис. 1В). При этом наблюдали статистически достоверное снижение скорости прогрессии нейродегенеративного процесса на терминальной стадии модельного заболевания, что выражалось в увеличении продолжительности симптоматической стадии (Рисунок 1Г).
Рис.1.
А. Сравнение выживаемости (по Каплану-Мейеру) в трех экспериментальных и контрольной группах модельных животных, получавших препарат с возраста 63 дней.
Б.
Сравнение выживаемости (по Каплану-Мейеру ) в группах, получавшей препарат в дозе 11 мг/кг, начиная с возраста 63 дней, и контрольной (*p =0,047).
В. Возраст манифестации клинических симптомов модельного заболевания (дни). 1-контрольная группа, 2- группа, получавшая препарат с возраста 63 дней в дозе 5 мг/кг, 3- группа, получавшая препарат с возраста 63 дней в дозе 11 мг/кг (*p=0,023), 4-группа, получавшая препарат с возраста 63 дней в дозе 70 мг/кг.
Г.
Длительность течения модельного заболевания (дни). 1-контрольная группа, 2-группа, получавшая препарат с возраста 63 дней в дозе 5 мг/кг, 3- группа, получавшая препарат с возраста 63 дней в дозе 11 мг/кг (*p=0,019), 4-группа, получавшая препарат с возраста 63 дней в дозе 70 мг/кг.
Морфометрический анализ мотонейронов в вентральных рогах спинного мозга трансгенных мышей показал, что группа
животных, получавшая Димебон, занимает промежуточное положение между нетрансгенными и трансгенными контрольными животными по количеству мотонейронов в период пресимтоматической стадии, хотя среднее значение достоверно не отличается ни от одной из двух групп (Рисунок 2). На репрезентативной фотографии вентральных рогов спинного мозга (Рисунок 3) видно, что у животных, принимавших Димебон, число здоровых мотонейронов визуально превышает таковые у трансгенных мышей на обоих стадиях развития заболевания.
Рис.3. Репрезентативные микрофотографии мотонейронов в вентральных рогах спинного мозга экспериментальных мышей. «а» – NTG (нетрансгенные животные), «б» – TG (трансгенные животные), «в» и
«г» TGterminal (трансгенные животные на
терминальных стадиях заболевания) «в» – без Димебона, «г» – животные, получавшие препарат Димебон. «д», «е», «ж», «з» – увеличенное изображение участка обведенного рамкой на соответствующих фотографиях спинного мозга. Линейка – 30 мкм.
Результаты проведенного исследования дают основание рассматривать Димебон в качестве основы для разработки патогенетической терапии БАС, создание которой является исключительно актуальной задачей в связи с ограниченными терапевтическими ресурсами. В настоящее время ведутся разработки по созданию новых подходов в терапии БАС, основанных на использовании современных биотехнологических методов (Ismailov et al. 2014) и методов заместительной терапии утраченных двигательных нейронов у больных на поздних стадиях (Calvo et al. 2014). Создание же фармакологических препаратов, обладающих терапевтическим эффектом при БАС, рассматривается
в качестве необходимой составляющий комплексной терапии. Возможно способность Димебона замедлять прогрессию протеинопатии обусловлена активацией собственных внутриклеточных систем контролируемой деградации патогенных белковых комплексов, уменьшая количество внутриклеточных депозитов и
их промежуточных токсичных продуктов агрегации (Khritankova et al.). Возможно, этим может быть обусловлен его эффект на продолжительность жизни модельных животных, который проявляется за счѐт более позднего дебюта модельного заболевания.
В работе использовано оборудование ЦКП ИФАВ РАН (Соглашение № 14.621.21.0008, идентификатор работ RFMEFI62114X0008).
Список литературы
1.
Bachurin, S.O. et al., 2013. [Modeling of
lateral amyotrophic sclerosis: a transgenic method]. Zhurnal nevrologii i psikhiatrii
imeni S.S. Korsakova / Ministerstvo zdravookhraneniia i meditsinskoĭ promyshlennosti Rossiĭskoĭ Federatsii, Vserossiĭskoe obshchestvo nevrologov [i] Vserossiĭskoe obshchestvo psikhiatrov, 113(10), pp.74–9. Available at: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24404652 [Accessed September 29, 2015].
2.
Bachurin, S.O. et al., 2012.
Dimebon slows
progression of
proteinopathy in
γ-synuclein transgenic
mice. Neurotoxicity research, 22(1),pp.33–42. Available at: http://www.pubmedcentral.nih.gov/articlerender.fcgi?artid=3351599&tool=pmcentrez&rendertype=abstract [Accessed September 8, 2015].
3.
Blokhuis, A.M. et al., 2013. Protein aggregation in amyotrophic lateral sclerosis. Acta neuropathologica, 125(6), pp.777–94. Available at: http://www.pubmedcentral.nih.gov/articlerender.fcgi?artid=3661910&tool=pmcentrez&rendertype=abstract [Accessed August 19, 2015].
4.
Calvo, A.C. et al., 2014.
Amyotrophic lateral
sclerosis: a focus
on disease progression.
BioMed research international, 2014, p.925101. Available at: http://www.pubmedcentral.nih.gov/articlerender.fcgi?artid=4137497&tool=pmcentrez&rendertype=abstract [Accessed September 15, 2015].
5.
Deikin, a V et al., 2014. [A mice model of amyotrophic lateral sclerosis expressing mutant human FUS protein.].Zhurnal nevrologii i psikhiatrii imeni S.S. Korsakova / Ministerstvo zdravookhraneniia i meditsinskoi promyshlennosti Rossiiskoi Federatsii, Vserossiiskoe obshchestvo nevrologov [i] Vserossiiskoe obshchestvo psikhiatrov, 114(8), pp.63–70.
6.
Doody, R.S. et al., 2008. Effect of dimebon on cognition, activities of daily living, behaviour, and global function in patients with mild-to-moderate Alzheimer’s disease: a randomised, double-blind, placebo-controlled study. Lancet (London, England), 372(9634), pp.207–15. Available at: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18640457 [Accessed September 20, 2015].
7.
Ismailov, S.M. et al., 2014. [Experimental approach to the gene therapy of motor neuron disease with the use of genes hypoxia-inducible factors]. Genetika, 50(5), pp.591–601. Available at: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25715475 [Accessed September 29, 2015].
8.
Khritankova, I. V et al., Dimebon activates
autophagosome components
in human neuroblastoma SH-SY5Y cells.Doklady. Biochemistry and biophysics, 446, pp.251–3. Available at: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23132721 [Accessed September 29, 2015].
9.
Ling, S.-C., Polymenidou, M. & Cleveland, D.W., 2013. Converging mechanisms in ALS and FTD: disrupted RNA and protein homeostasis. Neuron, 79(3), pp.416–38. Available at: http://www.pubmedcentral.nih.gov/articlerender.fcgi?artid=4411085&tool=pmcentrez&rendertype=abstract [Accessed July 10, 2014].
10. Orrell, R.W., 2010. Motor neuron disease: systematic reviews of treatment for ALS and SMA. British medical bulletin, 93, pp.145–59. Available at: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20015852 [Accessed September 7, 2015].
11. Peters, O.M. et al., 2013. Chronic administration
of
dimebon ameliorates
pathology in TauP301S
transgenic mice.Journal of Alzheimer’s disease : JAD, 33(4), pp.1041–9. Available at: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23099813 [Accessed September 29, 2015].
12. Pieper, A.A. et al., 2010. Discovery of a Proneurogenic, Neuroprotective Chemical. Cell, 142(1), pp.39–51.Available at:
http://www.pubmedcentral.nih.gov/articlerender.fcgi?artid=2930815&tool=pmcentrez&rendertype=abstract [Accessed September 29, 2015].
13. Shelkovnikova, T.A. et al., 2014. Compromised paraspeckle formation as a pathogenic factor in FUSopathies.
Human molecular genetics, 23(9), pp.2298–312. Available at: http://www.pubmedcentral.nih.gov/articlerender.fcgi?artid=3976330&tool=pmcentrez&rendertype=abstract [Accessed September 29, 2015].
14. Shelkovnikova, T.A., Peters, O.M., et al., 2013. Fused in sarcoma (FUS) protein lacking nuclear
localization signal (NLS) and major RNA binding motifs triggers proteinopathy and severe motor phenotype in transgenic mice. The Journal of biological chemistry, 288(35), pp.25266–74. Available at: http://www.pubmedcentral.nih.gov/articlerender.fcgi?artid=3757190&tool=pmcentrez&rendertype=abstract [Accessed September 29, 2015].
15. Shelkovnikova, T.A., 2013. Modelling FUSopathies: focus on protein aggregation. Biochemical Society transactions, 41(6), pp.1613–7. Available at: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24256263 [Accessed September 29, 2015].
16. Shelkovnikova, T.A. et al., 2014. Multistep process of FUS aggregation in the cell cytoplasm involves RNA- dependent and RNA-independent mechanisms. Human Molecular Genetics, 23(19), pp.5211–5226. Available at: http://www.pubmedcentral.nih.gov/articlerender.fcgi?artid=4159159&tool=pmcentrez&rendertype=abstract [Accessed September 29, 2015].
17. Shelkovnikova, T.A., Robinson, H.K., et al., 2013. Recruitment into stress granules prevents irreversible aggregation of FUS protein mislocalized
to the cytoplasm. Cell cycle (Georgetown, Tex.), 12(19), pp.3194–202. Available
at:
http://www.pubmedcentral.nih.gov/articlerender.fcgi?artid=3865015&tool=pmcentrez&rendertype=abstract [Accessed September 29, 2015].
18. Skvortsova, V.I. et al., 2011. [New aspects of the pathogenesis of lateral amyotrophic sclerosis]. Zhurnal nevrologii i psikhiatrii imeni S.S. Korsakova / Ministerstvo zdravookhraneniia i meditsinskoĭ promyshlennosti Rossiĭskoĭ Federatsii, Vserossiĭskoe obshchestvo nevrologov [i] Vserossiĭskoe obshchestvo psikhiatrov, 111(2), pp.4–9. Available at: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21510103 [Accessed September 29, 2015].
19. Steele, J.W. et al., 2009. Acute dosing of latrepirdine (DimebonTM), a possible Alzheimer therapeutic, elevates extracellular amyloid-β levels in vitro
and in
vivo. Molecular Neurodegeneration, 4(1), p.51.
Available at: http://www.pubmedcentral.nih.gov/articlerender.fcgi?artid=2806870&tool=pmcentrez&rendertype=abstract [Accessed September 29, 2015].
20. Yamashita, M. et al., 2009. Methylene blue and dimebon inhibit aggregation of TDP-43 in cellular models. FEBS letters, 583(14), pp.2419–24. Available at: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19560462 [Accessed September 29, 2015].
21. С.О. Бачурин, A.A. Устюгов, O. Петерс, T.A. Шелковникова, В.Л. Бухман, Н.Н.Н., 2009. Блокада нейродегенеративных процессов, вызванных протеинопатией, как новый механизм действия нейропротекторных и когнитивно-стимулирующих препаратов. Доклады Академии наук: Биохимия и Биофизика, 428(2), pp.262–265.
