ВЛИЯНИЕ РИЗОСФЕРНЫХ ШТАММОВ PSEUDOMONAS НА КОЛИЧЕСТВО L-ТРИПТОФАНА В КОРНЕВЫХ ЭКССУДАТАХ ПШЕНИЦЫ И ТОМАТА

Одним из основных практических аспектов применения биопрепаратов на основе ризосферных бактерий является их способность стимулировать рост растений (Hassan and Bano, 2015). Продуцирование фитогормонов (ауксинов, цитокининов и гиббереллинов), витаминов и других биологически активных веществ ризобактериями является одним из важнейших механизмов взаимодействия в растительно-бактериальных ассоциациях (Frankenberger and Arshad, 1995; Цавкелова и др., 2006). Наибольшее внимание уделяется роли бактериальных ауксинов в стимуляции роста и питания растений, поскольку способность синтезировать ауксин – индолил-3-уксусную кислоту (ИУК) – широко распространена среди ризобактерий (Frankenberger and Arshad, 1995). По современным оценкам около 80% бактериальных изолятов из ризосферной почвы способны синтезировать ИУК (Idris et al., 2004). Синтез ИУК ризосферными микроорганизмами в значительной степени определяется составом корневых экссудатов, содержащих основной метаболитический предшественник для биосинтеза ауксинов – аминокислоту L- триптофан (Frankenberger and Arshad, 1995; Villareal et al., 2012). Соответственно, оценка корневой экссудации L-триптофана у перспективных сортов и селекционного материала, изучение ее взаимосвязи с эффективностью ростстимулирующих биопрепаратов является в настоящее время одной из актуальных задач в области селекции продуктивных сельскохозяйственных культур.

Цель настоящей работы – оценить влияние инокуляции растений пшеницы и томата ростстимулирующими штаммами ризобактерий р. Pseudomonas на количество L- триптофана в корневых экссудатах. В работе использовали пшеницу Triticum aestivum L. сорта Обелиск и томат Lycopersicon esculentum L. сорта Kapмeлло. Для инокуляции растений использовали штаммы Pseudomonas chlororaphis SPB1217 и Pseudomonas fluorescens SPB2137, являющиеся активными колонизаторами корней, обладающие биоконтрольной и ростстимулирующей активностью (Кравченко,и др., 2002; Кравченко и др., 2004). Семена пшеницы стерилизовали 6 мин 0,1% раствором сулемы, семена томата–      3 мин 4% гипохлоритом, и затем проращивали в чашках Петри на влажной фильтровальной бумаге в термостате при 28oC в течение двух суток. Проростки высаживали в стерильные сосуды с пластиковыми сетками и минеральным раствором (мг/л дистиллированной воды: CaCl2 – 556; KNO3 – 658; MgCl2 × 6H2O – 50; (NH4)2SO4 – 13; NH4NO3 – 32; pH=6,5) и выращивали 10 суток в фитотроне при 220С (16 ч день/ 8 ч ночь). Бактерии вносили одновременно с посадкой стерильных проростков в количестве 105   KOE/мл. Численность бактерий определяли в растворе и на корнях методом последовательных разведений высевом на агаризованную среду LB (Sambrook et al., 1989). Для определения количества L-триптофана корневые экссудаты фильтровали под вакуумом через мембранный фильтр с порами 0,2 мкм и концентрировали при 450С на роторном вакуумном испарителе BUCHI R-200 (BUCHI, Швейцария) до объема 1 мл.

Анализ проводили с использованием системы Waters Acquity UPLC H-class (Waters, США). Анализ проводится на колонки Waters UPLC RP-18 BEH Shield (Waters, США) при помощи флуоресцентного детектора (λEX = 280нм, λEM = 350нм). В качестве подвижной фазы использовали 4% ацетонитрил при скорости потока 0,3 мл/мин и температуре колонки 300С. Результаты представлены средними величинами из трех повторностей со стандартным отклонением.

Результаты экспериментов показали, что стерильные растения пшеницы и томата значительно различаются по интенсивности корневой экссудации L-триптофана. За 10 суток вегетации она составила у пшеницы 102,4 нг/растение (рис. 1), тогда как у томатов в 29,3 раз меньше – 3,5 нг/растение (рис. 2).

Инокуляция растений пшеницы ризобактериями P. fluorescens SPB2137 и P. chlororaphis SPB1217 привела к значительному снижению количества L-триптофана в минеральном растворе (рис. 1). В варианте с инокуляцией штаммом SPB2137 его количество снижалось в 5 раз (20,3 нг/растение), при инокуляции штаммом SPB1217 – в 3,5 раза (29 нг/растение).

Анализ содержания L-триптофана в корневых экссудатах инокулированных растений томата показал, что его количество либо остается на уровне экссудатов стерильных растений (в варианте со штаммом SPB1217), либо, при инокуляции штаммом SPB2137, увеличивается в среднем в 2,3 раза (рис. 2).

В минеральном растворе единственным питательным субстратом для роста ризобактерий являлись корневые экссудаты. Корневая экссудация как растений пшеницы, так и томата поддерживала интенсивный рост штаммов – их численность в растворе увеличивалась на 2 порядка относительно стартового количества (табл. 1). Наблюдалась также и активная колонизация бактериями корней, причем корни пшеницы значительно активнее заселял штамм P. chlororaphis SPB1217 (табл. 1). Более высокая численность этого штамма определяла и его активное влияние на рост корней пшеницы – их биомасса была в 1,8 раза ниже, чем у стерильных растений и в 1,5 раза ниже, чем при инокуляции растений штаммом P. fluorescens SPB2137, при этом биомасса побегов в обоих вариантах инокуляции оставалась на уровне контроля (табл. 2). Следует отметить, что штамм SPB1217 продуцировал при росте на корневых экссудатах редиса, богатых L- триптофаном, в 3,3 раза больше ИУК, чем штамм SPB2137 (Кравченко, 2000). Вероятно, с активным биосинтезом ИУК в минеральном растворе и в корневой зоне связано и ингибирующее влияние штамма SPB1217 на биомассу корней пшеницы.

При инокуляции растений томата достоверного влияния ризобактерий на биомассу корней и побегов выявлено не было (табл. 2), что совпадает с ранее полученными данными о взаимосвязи низкой экссудации L-триптофана корнями томата с отсутствием отзывчивости растений на инокуляцию ростстимулирующими ризобактериями (Кравченко и др., 2004). Отсутствие снижения количества L-триптофана при инокуляции (а в случае штамма SPB2137 даже возрастание его количества в 2,3 раза) можно объяснить, с одной стороны, отсутствием его утилизации, с другой – усилением его экссудации под действием бактериальных экзометаболитов. Известно, что ряд микробных продуктов, в том числе антибиотики, способны усиливать экссудацию аминокислот корнями (Phillips et al., 2004). Штамм SPB1217 продуцирует производные феназина, а штамм SPB2137 – неидентифицированный антифунгальный метаболит (Кравченко, 2000; Штарк и др., 2003).

Таблица 1. Численность ризобактерий

Таблица 2. Биомасса растений при инокуляции ризобактериями

Контроль – стерильные растения

Возможность генетической модификации растений с целью изменения состава и количества корневых экзометаболитов открывает пути для создания новых микробно- растительных систем с улучшенной способностью к адаптации в стрессовых условиях и высокой продуктивностью (Rengel, 2002). Одним из перспективных направлений современных селекционных программ является селекция генотипов с повышенным содержанием в корневых экссудатах специфических компонентов, влияющих на активность микроорганизмов в ризосфере (Rengel, 2002). Эксперименты с внесением в почву L-триптофана показали его положительный эффект на рост ряда сельскохозяйственных культур, в том числе пшеницы (Mohite, 2013). Таким образом, скрининг существующих сортов и селекционного материала по корневой экссудации L- триптофана, а также изучение влияния корневых экссудатов на активность ростстимулирующих ризобактерий представляется одним из необходимых условий максимальной мобилизации генетических ресурсов растений и ризобактерий для создания эффективных микробно-растительных агросистем.

Работа по анализу корневых экссудатов пшеницы выполнена при финансовой поддержке РФФИ (грант № 15-04-09023-а).

Список литературы

1.      Кравченко Л.В. Роль корневых экзометаболитов в интеграции микроорганизмов с растениями: дис. … д-ра биол. наук. – Москва, 2000. 434 с.

2.      Кравченко Л.В, Макарова Н.М., Азарова Т.С. и др. Выделение и фенотипическая характеристика ростстимулирующих ризобактерий (PGPR), сочетающих высокую активность колонизации корней и ингибирования фитопатогенных грибов // Микробиология. 2002. Т. 71. №4. С. 521-525.

3.      Кравченко Л.В., Азарова Т.С, Макарова Н.М., Тихонович И.А. Роль триптофана корневых экзометаболитов при фитостимулирующей активности ризобактерий// Микробиология. 2004. Т. 73. № 2. С. 195-168.

 4.      Цавкелова Е.А., Климова С.Ю., Чердынцева Т.А., Нетрусов А.И. Микробные продуценты стимуляторов роста растений и их практическое использование: обзор // Прикладная Биохимия и Микробиология. 2006. № 2. С. 133-143.

5.      Штарк О.Ю., Шапошников А.И., Кравченко Л.В. Продуцирование антифунгальных метаболитов Pseudomonas chlororaphis при росте на различных источниках питания // Микробиология. 2003. Т. 72. № 5. С. 645-650.

6.      Frankenberger W.T., Arshad M. Phytohormones in soils: production and function.Marcel Dekker, Inc. N.Y. – 1995. – 503 p. 

7.      Hassan T.U., Bano A. The stimulatory effects of L-tryptophan and plant growth promoting rhizobacteria (PGPR) on soil health and physiology of wheat // J. Soil Sc. Plant Nutr. 2015. V. 15. P. 190-201.

8.      Idris E., Bochow E.S., Ross H., Borriss R. Use of Bacillus subtilis as biocontrol agent. VI. Phytohormone like action of culture filtrates prepared from plant growth- promoting Bacillus amyloliquefaciensFZB24, FZB42, FZB45 and Bacillus subtilis FZB37 //  J. Plant Dis. Prot. 2004. V. 111. P. 583-590.

9.      Mohite B. Isolation and characterization of indole acetic acid (IAA) producing bacteria from rhizospheric soil and its effect on plant growth // J. Soil Sci. Plant Nutr. 2013. V. 13. N 3. P. 638-649.

10. Phillips D.A., Fox C.T., King M.D., Bhuvaneswari T.V., Teuber L.R. Microbial products trigger amino acid exudation from plant roots // Plant Physiology. 2004. V. 136. P. 2887-2894.

11. Rengel Z. Genetic control of root exudation // Plant and Soil. 2002. V. 245. P. 59-70. 

12. Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor: Cold Spring Harbor Lab., 1989.

13. Villareal, S.Q., Hernández, N.Z., Romero, I.L., Lazcano, E.A., Dorantes, A.R. Assessment of plant growth promotion by rhizobacteria supplied with tryptophan as phytohormone production elicitor on Axonopus affinis // Agri. Sci. Res. J. 2012. V. 2. N 11. P. 574- 580.