11 марта 2016г.
Поиск эффективных способов лечения мышечных заболеваний, в частности миодистрофий, позволил обнаружить новые источники миогенных клеток. Существуют немногочисленные свидетельства присутствия предшественников скелетных мышц в нетипичной локализации. Ранее миогенные предшественники были обнаружены в органах куриного эмбриона, мыши и в печени крысы. Изучение комитированных миогенных предшественников эктопической локализации является актуальным в связи с тем, что повреждение тканей с последующим воспалением может активировать пролиферацию этих клеток. Кроме того, такие клетки могут быть подвержены трансформации. Предполагается, что миогенные предшественники неорганотипической локализации могут быть причиной образования рабдомиосарком.
В современной литературе нет данных о природе, потенциях и локализации миогенных предшественников в различных органах. Первые свидетельства того, что клетки с миогенным потенциалом можно обнаружить в немышечных тканях были получены в 2000 году [4]. Герхарт и соавт. показали, что клетки, экспрессирующие транскрипционные факторы, специфичные для скелетных мышц (например MyoD), в небольшом количестве распределены по всему эпибласту (первичная эктодерма), мезодерме и эндодерме, то есть во всех трех зародышевых листках, у куриного эмбриона. Myf5 также был обнаружен в немиогенной мезодерме [6]. Эти результаты стали основанием для выдвижения гипотезы, согласно которой клетки-предшественники, имеющие миогенные потенции, включены в эмбриональные органы, развивающиеся из всех трех зародышевых листков, но сохраняются в качестве предшественников в непермиссивных условиях. Данную гипотезу подтверждает тот факт, что MyoD-позитивные клетки были обнаружены на более поздних стадиях развития куриных эмбрионов в тканях, не участвующих в образовании скелетных мышц, например, в нервной трубке [4]. Экспрессию Myf5 также обнаружили в клетках головного и спинного мозга эмбрионов мыши [7]. Группа итальянских ученых показала, что желточный мешок и легкие эмбрионов мыши содержат клетки-предшественники, экспрессирующие эндотелиальные маркеры и имеющие миогенный потенциал. В этой работе также было показано, что число таких клеток-предшественников быстро снижается в процессе развития и достигает очень низкого значения у половозрелых животных [2]. Однако Ди Рокко с соавт. показали, что миогенные предшественнники присутствуют и в ряде органов половозрелых мышей, в частности в поджелудочной железе, селезенке, желудке и в приаортальной области [3]. Ранее миогенные предшественники были обнаружены нами в печени зародышей крыс [1].
Природа миогенных клеток в немышечных тканях остается не известной. Существуют данные, что по своим свойствам эктопические миогенные предшественники отличаются от мезангиобластов, миофибробластов и фибробластов, клеток костного мозга, клеток эмбриональной дорсальной аорты и нервных стволовых клеток [5].
Целью данной работы было: идентифицировать миогенные клетки в различных органах крысы на разных стадиях пренатального развития и изучить миогенные потенции клеток из этих органов in vitro.
Методы:
В работе использовали 16- и 20-суточные зародыши крыс Вистар. Из 16- суточных зародышей выделяли сердце, желудок, кишечник, из 20-суточных зародышей – сердце, желудок кишечник, тимус и селезенку. Нативные органы зародышей использовали для приготовления криостатных срезов и исследовали их с целью обнаружения клеток, экспрессирующих мышечный маркер MyoD in situ.
Из всех фетальных органов получали также суспензии клеток. Клетки в концентрации 1х106 кл/мл
помещали в культуральные платы или матрасы, покрытые фибронектином, и культивировали до формирования скоплений миотуб или до образования 90-95% конфлуэнтного монослоя (10-12 сут.). В качестве положительного контроля использовали первичную культуру клеток, полученных из мышц задних конечностей зародышей. Первичные культуры использовали для морфологического анализа, иммуноцитохимического анализа (маркер скелетных мышц MyoD, миозин 2 типа), и ПЦР.
Результаты:
Иммуноцитохимическое окрашивание криостатных срезов различных органов 16 и 20-суточных зародышей выявило наличие единичных клеток, содержащих МyoD, в сердце 16-суточных зародышей, а также в кишечнике, тимусе и селезенке 20-суточных зародышей. Полученные данные указывают на широкое, но не повсеместное распространение клеток-предшественников скелетных мышц в организме зародыша крысы.
Спонтанное образование миотуб наблюдали в культурах, полученных из стромальных клеток сердца и кишечника 16-дневных зародышей, и в культурах, полученных из стромальных клеток тимуса и селезенки 20- дневных зародышей. В культурах клеток из сердца и кишечника зародышей миотубы были единичными, лежали отдельно друг от друга, тогда как в таковых из тимуса и селезенки зародышей миотубы образовывали кластеры и были более многочисленны. По морфологии и динамике образования полученные миотубы не отличались от миотуб в контрольных культурах мышц. Миотубы представляли собой вытянутые веретеновидные образования, содержащие различное количество ядер и отличающиеся интенсивной базофилией цитоплазмы, что свидетельствует об активном синтезе белков. В культурах клеток желудка формирования миотуб не наблюдали.
Результаты иммуноцитохимического окрашивания на маркер MyoD подтвердили скелетномышечную природу полученных миотуб и не выявили отличий от миотуб в контрольной культуре. Миозин 2 типа, маркер зрелых мышечных трубочек, был обнаружен только в миотубах, полученных из клеток селезенки 20-суточных зародышей. Кроме того, в этой же культуре клеток миотубы были наиболее многочисленные, крупные и разветвленные. На основе этих данных мы можем предположить, что миотубы селезенки среди исследованных нами первичных культур фетальных органов обладали наибольшей зрелостью.
ПЦР-анализ культур клеток из сердца, желудка, кишечника, тимуса и селезенки показал слабую экспрессию гена MyoD во всех этих культурах и гена м-кадгерина в культурах клеток из кишечника, тимуса и селезенки 20-суточных зародышей. В культуре МСК из костного мозга (негативный контроль) экспрессии этих генов не наблюдали, а в культурах клеток из мышц задних конечностей (положительный контроль) она была на высоком уровне.
По результатам, полученным в данной работе, мы можем сделать следующие выводы:
1) В нативных сердце 16-суточных плодов, в кишечнике, тимусе и селезенке 20-суточных плодов присутствуют миогенные предшественники.
2) В первичных культурах из сердца и кишечника на 16-е сутки пренатального развития, а также из тимуса и селезенки на 20-е сутки пренатального развития крысы формируются миотубы, имеющие скелетно-мышечную природу.
3) Наибольшими миогенными потенциями из исследуемых органов обладает селезенка.
Таким образом, клетки-предшественники скелетных мышц, по-видимому, распространены в самых разных органах в пренатальном развитии крыс. Причины появления миогенных предшественников нетипичной локализации и сохранения их в непермиссивных условиях должны стать предметом дальнейших исследований.
Список литературы
1. Шевелева О.Н., Паюшина О.В., Кожевникова М.Н., Буторина Н.Н., Старостин В.И. Спонтанный и индуцированный миогенез при культивировании клеток печени зародышей крысы // Цитология. 2011. Т. 53. № 11. С. 874-883.
2. Cusella De Angelis M.G., Balconi G., Bernasconi S., Zanetta L., Boratto R., Galli D., Dejana E., Cossu G. Skeletal myogenic progenitors in the endothelium of lung and yolk sac // Exp Cell Res. 2003. V. 290(2). P. 207-16.
3. Di Rocco G., Tritarelli A., Toietta G., Gatto I., Iachininoto M.G., Pagani F., Mangoni A., Straino S., Capogrossi MC. Spontaneous myogenic differentiation of Flk-1-positive cells from adult pancreas and other nonmuscle tissues // Am J Physiol Cell Physiol. 2008. V. 294. P. 604–612.
4. Gerhart J., Baytion M., DeLuca S., Getts R., Lopez C., Niewenhuis R., Nilsen T., Olex S, Weintraub H, George- Weinstein M. DNA Dendrimers Localize MyoD mRNA in Presomitic Tissues of the Chick Embryo // The Journal of Cell Biology. 2000. V. 149. № 4. P. 825–833.
5. Gerhart J., Bast B., Neely C., Iem S., Amegbe P., Niewenhuis R., Miklasz S., Cheng P.F., George-Weinstain M. MyoD-positive myoblasts are present in mature fetal organs lacking skeletal muscle // The Journal of Cell Biology. 2001. V. 155. P. 381–391.
6. Kiefer J.C., Hauschka. S.D. Myf-5 is transiently expressed in non-muscle mesoderm and exhibits dynamic regional changes within the presegmented mesoderm and somites I-IV // Dev. Biol. 2001. V. 232. P. 77–90.
7. Tajbakhsh S., Vivarelli E., Cusella-De-Angelis G., Rocancourt D., Buckingham D.M., Cossu G. A population of myogenic cells derived from the mouse neural tube // Neuron. 1994. V. 13. P. 813–821.
