06 января 2016г.
Реферат
Ключевые слова: производственное объединение «Маяк», потомки, антенатальное облучение, хромо- сомные аберрации, анеуплоидия.
Целью настоящего исследования являлась оценка частоты хромосомных нарушений у лиц, подвергшихся хроническому антенатальному облучению. Изучаемой группой являлись потомки работников ПО «Маяк», подвергшиеся антенатальному облучению в широком диапазоне доз. В результате проведенного исследования установлено, что частота стабильных хромосомных аберраций (ХА) у потомков облученных родителей была статистически значимо выше, чем в контрольной группе и обусловлена повешенной частотой транслокаций. Установлена высокая частота ануеплоидных клеток. Частота анеуплоидных клеток, выявленных у потомков облученных родителей, статистически значимо превышала частоту, установленную для группы лиц соответствующего возраста, не подвергавшихся антенатальному облучению.
Введение
Многочисленные экспериментальные исследования на животных выявили высокую чувствительность эмбриона и плода к воздействию ионизирующего излучения. В тоже время данные по цитогенетическим эффектам среди антенатально облученных людей крайне ограничены. Разработанные в последние годы современные цитогенетические методы позволяют провести исследование цитогенетических эффектов у антенатально облученных индивидов.
В эксперименте на потомстве самцов мышей, подвергавшихся малым дозам хронического гамма- облучения, было показано наличие радиационно-индуцированных хромосомных аберраций (ХА), что обуславливает нестабильность генома, т.е. повышенный генетический риск [12].
Исследования лиц, облученных внутриутробно в дозе не менее 1 Гр при взрыве Хиросимы и Нагасаки, выявили значительное повышение уровня ХА по сравнению с контролем [1, 6]. Грубые хромосомные перестройки в культуре лимфоцитов периферической крови описаны у детей, подвергшихся облучению внутриутробно в связи с лечением матери в период беременности по поводу злокачественных опухолей [3, 4]. При проведении цитогенетического исследования эмбрионов после аборта и 23 детей, облученных в антенатальном периоде, были выявлены как хроматидные, так и ХА [7].
Целью настоящего исследования являлась оценка частоты хромосомных нарушений у лиц, подвергшихся хроническому антенатальному облучению.
Материалы и методы исследования
Для проведения цитогенетического исследования были идентифицированы и приглашены 25 потомков облученных родителей, большинство из которых составили женщины (76%). Средний возраст потомков был 55,2 ± 0,4 лет. Дозы за беременность в идентифицированной группе были в диапазоне 14 – 687 мГр. В качестве контрольной группы выбраны потомки жителей г. Озерска, не подвергавшихся антенатальному облучению, результаты цитогенетического обследования которых представлены в работе [15].
Культивировали цельную венозную кровь. Время культивирования лимфоцитов в настоящем исследовании составляло 48 часов. Колхицин добавляли за 4 часа до фиксации Клетки фиксировали охлажденной до 00С смесью этилового спирта и ледяной уксусной кислоты (3:1). Суспензию клеток наносили на охлажденные влажные предметные стекла и высушивали на водяной бане.
Гибридизация хромосомных препаратов mFISH осуществлялась согласно протоколу 24XCyte lab manual MetaSystems. Денатурация хромосомных препаратов проводилась в 0,07 N NaOH. Пробы денатурировали параллельно с препаратами. Хромосомные препараты с нанесенными зондами инкубировали 96 часов. После отмывки препаратов и детекции гибридизационных сигналов на препарат наносили контркраситель DAPI.
Захват изображений метафазных разбросов и кариотипирование проводили с помощью флуоресцентного микроскопа Leica DMRA2 с использованием набора фильтров DAPI, FITC, Texas Red, Spectrum Orange, DEAC, Cy5 и программного обеспечения ISIS4 Metasystems. Для каждого индивида анализировали 100-150 метафазных разбросов. Учитывали все типы хромосомных и хроматидных аберраций. Всего проанализировано 3137 клеток. Количество аберраций оценивали на 100 проанализированных метафаз.
Результаты и обсуждение
В результате исследования у потомков работников ПО «Маяк» были зарегистрированы аберрации как хроматидного, так и хромосомного типа. К аберрациям хроматидного типа относили хроматидные пробелы, разрывы, фрагменты, обмены. ХА были представлены в основном транслокациями, ацентрическими фрагментами, делециями и дицентрическими хромосомами. Аберрации хроматидного типа в исследуемой группе встречались с той же частотой, что и в контрольной группе. Нестабильные ХА в настоящем исследовании были представлены дицентрическими хромосомами и разрывами по центромере; стабильные ХА – транслокациями и концевыми делециями. В одном случае был обнаружен клеточный клон.
Частота нестабильных (0,33 0,09) и стабильных (2,32 0,27) ХА, как по отдельности, так и в целом (2,660,30) в исследуемой группе, была выше, чем в контроле (0,16 0,04; 0,16 0,03 и 0,36 0,06 соответственно). В тоже время, различия в частоте нестабильных ХА не были статистически значимыми, и их частота соответствовала литературным данным для лиц соответствующего возраста [13]. Повышенная по сравнению с контрольной группой частота ХА в изучаемой группе объясняется различием в возрасте лиц основной (55,2 ± 0,4 лет) и контрольной группы (36,0 ± 0,5 лет). Согласно данным международного исследования [10] средняя популяционная частота стабильных ХА – транслокаций – в возрастной группе 50 – 59 лет составляет 0,89 ± 0,13. Частота транслокаций в группе потомков облученных родителей статистически значимо превышала значение частоты данного типа аберраций для контрольных групп и составила 1,88 ± 0,31. Полученный результат хорошо согласуется с данными, выявленными у лиц, облученных антенатально в результате взрыва в Хиросиме и Нагасаке [1, 6]
В настоящем исследовании кроме структурных нарушений были выявлены числовые нарушения хромосом – анеуплоидии (АЕ). Было установлено, что частота АЕ у потомков облученных людей составила 11,5 ± 1,1 на 100 клеток. При углубленном анализе частоты анеуплоидных клеток выявлено, что частота АЕ по аутосомам составила 8,2 ± 0,9 на 100 клеток, по половым хромосомам – 3,2 ± 0,6 на 100 клеток.
АЕ является основной причиной врожденных пороков развития и эмбриональной гибели. Не смотря на то, что патологическая значимость появления АЕ под действием различных факторов не ясна, было предположено, что числовые хромосомные нарушения оказывают большее влияние на развитие патологий у человека, чем структурные ХА [16].
В работе [14] при исследовании влияния на организм человека факторов ядерно-химического производства было показано, что значимое возрастание уровня АЕ по шести изученным хромосомам (7, 11, 12, 17, Х и Y) проявлялось только в культивированных лимфоцитах. Частота анеуплоидных клеток у лиц контрольной группы после культивирования составляла 2,26 ± 0,93 %. У индивидов, подвергавшихся воздействию комплекса внешнесредовых факторов, частота АЕ в культивированных лимфоцитах составила 2,98 ± 1,11 %.
Для выявления хромосом, чаще других вовлеченных в возникновение анеуплоидных клеток, был проведен анализ для каждой хромосомы. Наиболее частым случаем в данном исследовании была АЕ по Х хромосоме (2,87%). Согласно литературным данным Х-хромосома чаще теряется в культивированных женских клетках, что, вероятно, связано с ее инактивацией [11]. В работе [5] было показано, что к потере чаще подвержены хромосомы X, 17 и аутосомы, несущие крупные гетерохроматиновые блоки - 1, 9, 16. К эндогенным причинам можно отнести возрастную зависимость АЕ как по аутосомам, так и половым хромосомам [2, 9, 14]. В работе Leach с соавторами обнаружена значимая корреляция между частотой потери отдельной хромосомы и длиной ее теломеры, т.е. чем меньше был теломерный участок, тем чаще эта хромосома терялась [5]. В настоящем исследовании наибольшая частота АЕ по аутосомам наблюдалась для хромосомы 10 (0,57 %).
К сожалению, литературные данные по частоте АЕ у потомков облученных людей крайне ограничены. Предположительно, повышенная частота анеуплоидных клеток является проявлением нестабильности генома. Использование цитогенетических методов анализа в исследовании онкологических заболеваний установило, что АЕ характерны для опухолевых клеток и играют ключевую роль в их клональной эволюции [8]. В связи с этим повышенная частота АЕ требует пристального динамического наблюдения, а также углубленного анализа с увеличением числа обследованных потомков как облученных, так и необлученных родителей.
Заключение
В результате проведенного исследования у потомков облученных родителей выявлена более высокая частота стабильных ХА в исследуемой группе по сравнению с литературными данными для контрольных популяций соответствующей возрастной группы. Кроме того, установлено статистически значимое превышение частоты АЕ в изучаемой группе по сравнению с лицами контрольной группы. Числовые нарушения хромосом в клетках человека заслуживают пристального внимания в качестве потенциального индикатора ионизирующего излучения для лиц, облученных in utero.
Список литературы
1. Bloom AD, Neriishi Sh, Archer PG. Cytogenetic of the in-utero exposed of Hiroshima and Nagasaki. Lancet 2 (7558): 10-12 (1968).
2. Guttenbach M, Koschorz B, Bernthaler U et al. Sex chromosome loss and aging: in situ hybridization studies on human interphase nuclei. Am J Hum Genet 57: 1143-1150 (1995).
3. Kucerova M. Chromosome analysis of an infant after intrauterine irradiation. Acta Radiol 6 (5): 410-413 (1967).
4. Kucerova M. Long-term cytogenetic and clinical control of a child following intraurine irradiation. Acta Radiol Ther Phys Biol 61 (61): 103-144 (1970).
5. Leach NT, Rehder C, Jensen K, Holt S, Jackson-Cook C. Human chromosomes with shorter telomeres and large heterochromatin regions have a higher frequency of acquired somatic cell aneuploidy. Mech Ageing Dev 125 (8): 563-73 (2004).
6. Miller RW. Delayed radiation effects in atomic bomb survivors. Sci 166 (3905): 569-574 (1969).
7. Neumeister K. Findings in children after radiation exposure in utero from X-ray examination of mothers: results from children studied after one to seven years. Late Biological Effects of ionising Radiation, IAEA: Vienna,119- 134 (1978).
8. Rajagopalan H, Lengauer C. Aneuploidy and cancer. Nature. 432: 338-341 (2004).
9. Shi Q, Chen J, Adler I-D et al. Increased nondisjunction of chromosome 21 with age in human peripheral lymphocytes. Mut Res 452: 27-36 (2000).
10. Sigurdson A, Ha M, Hauptmann M et al. International study of factors affecting human chromosome translocations. Mut Res 652: 112-121 (2008).
11. Surralles J, Falck G, Norppa H. In vivo cytogenetic damage revealed by FISH analysis of micronuclei in uncultured human T-lymphocytes. Cytogen Cell Genet 75: 151-154. (1996).
12. Безлепкин ВГ, Васильева ВГ, Ломаева МГ и др. Исследование нестабильности генома методом анализа фингерпринтов ДНК потомства самцов мышей, подвергнутых хроническому гамма-облучению в малых дозах. Радиац Биол. Радиоэкол 40 (5): 506-512 (2000).
13. Любимова НЕ, Воробцова ИЕ. Влияние возраста и низкодозового облучения на частоту хромосомных аберраций в лимфоцитах человека. Радиац Биол. Радиоэкол 47 (1): 80-85 (2007).
14. Назаренко СА, Тимошевский ВА. Сравнительный анализ частоты анеуплоидии в покоящихся и делящихся клетках человека при воздействии вредных внешнесредовых факторов. Генетика 41 (3): 391-395 (2005).
15. Окладникова НД, Бурак ЛЕ, Дудченко НН. Цитогенетическая характеристика соматических клеток у первого поколения облученных людей. Воп радиац безопасности 1: 45-48 (2005).
16. Тимошевский ВА, Лебедев ИН, Назаренко СА. Биологическая индикация мутагенных воздействий: анализ числовых хромосомных нарушений в интерфазных клетках человека. Изд: Томск (2006).
