ИНИЦИАЦИЯ ОКИСЛИТЕЛЬНОГО СТРЕССА МОНОАМИНОКСИДАЗОЙ

Биогенные амины обладают высокой биологической активностью. Под действием дезаминирующих ферментов - различных форм моноаминоксидазы (К.Ф. 1.4.3.4) (МАО), реналазы, семикарбозид чувствительной аминоксидазы (SSAO), цитозольной МАО, диаминоксидазы (ДАО) образуются альдегиды и перекись водорода. По современным представлениям предполагается, что эти продукты участвуют в процессах окислительного стресса в различных органах млекопитающих [Kaludercic N. et al., 2014].

Ингибиторы аминоксидаз используются в качестве лекарственных средств при болезни Паркинсона, Альцгеймера, алкоголизме, депрессии [Pathak a. et al., 2015]. Показано также, что алкогольдегидрогеназа (АДГ) (К.Ф.1.1.1.1) помимо действия на биогенные амины, обуславливающее алкогольную мотивацию животных (Данилова и соавт., 2001), действует также на продукты реакции, катализируемой МАО. Также было показано, что помимо образующихся под действием МАО альдегидов, пропадающих под действием альдегиддегидрогеназы (АлДГ) (К,Ф,1.2.1.3), они являются хорошими субстратами ксантиноксидазы (КО) (К.Ф.1.1.1.1) [Холмина, Горкин, 1979]. Таким образом, представляется очевидным, что перечисленные выше ферменты образуют систему взаимосвязанных ферментов.

Нами исследовалось влияние ингибиторов АЛДГ, АДГ и КО на активность МАО - процесс накопления биогенных альдегидов - в печени в зависимости от торможения МАО под действием этих ферментов.

Материалы и методы.

Количество альдегида измеряли модифицированным спектрофотометрическим методом, используя методику Turski et al.,1972/1973 для определения бензальдегида. В качестве субстрата использовали 0,47мМ тирамин. Реакцию проводили в 1,5 мл К-Na фосфатного буфера рН 7,4 в присутствии 0,5-1 мг белка безъядерного гомогената печени крысы в течение 2 часов при 37º С. Реакцию останавливали равным объемом смеси 70% НСlO4 с 1,5 М семикарбозидом. Экстинкцию измеряли при 250нм сразу после остановки реакции и центрифугирования при 6000 об/мин. В некоторых опытах для определения активности использовали 100 мкМ С-14-тирамин, как описано ранее [Пеккель и соавт.,1987]. Экстракцию меченого альдегида проводили сцинтилляционной жидкостью. В работе использовали аллопуринол в качестве ингибитора ксантиноксидазы, тетурам – ингибитора альдегиддегидрореназы и 4-метилпиразол как ингибитор алкогольдегидрогеназы. Ингибиторы растворяли в диметилсульфоксиде или спирте, концентрация которых была от 0,01% до 10-30% в пробе, и учитывались в соответствующих контролях. В случае применения спирта инактивация ферментативной активности была менее выраженной, но принципиальных различий в действии ингибиторов не наблюдалось. Преинкубацию с ингибиторами проводили при 20º С в течение 20 минут.

Результаты и обсуждение.

В настоящее время биогенным альдегидам придается большое значение в окислительном стрессе [Kaludercic et al., 2014] вследствие образования под действием аминоксидаз альдегидов и перекиси. В качестве субстрата мы использовали тирамин, как общий субстрат различных форм аминоксидаз и дезаминирующийся с наибольшей скоростью, не отбрасывая возможности участия в этом процессе и других аминов. В Табл.1 представлены данные о максимальной степени накопления 4-оксифенилальдегида в исследуемых условиях по сравнению с контрольными пробами без ингибитора. Видна различная степень увеличения количества продукта, но максимальное накопление отмечено при использовании наиболее популярного средства торможения АлДГ - тетурама. Меньшее накопление альдегида наблюдали при использовании ингибиторов ксантиноксидазы - аллопуринола и алкогольдегидрогеназы - 4-метилпиразола. Однако можно сказать, что все ингибиторы влияют на количество образовавшегося под действием МАО продукта реакции при высоких концентрациях ингибиторов исследуемых ферментов. А далее при еще более высоких концентрациях ингибиторов – затухание аминоксидазной активности. Это означает, что ингибирование по типу обратной связи продуктом в этой системе ферментов происходит при высоких концентрациях альдегидов. Очевидно, этими кинетическими особенностями объясняется возникновение Паркинсонизма при старении - сочетанием увеличения образования альдегида и описанными особенностями каталитических свойств МАО. Эта наша точка зрения находит поддержку в опытах по изучению действия ротенона, хотя механизм возникновения Паркинсонизма при этом авторам не до конца понятен [Goldstein et al., 2015].

Таблица 1

*р < 0,01

**р < 0,005

Из анализа литературы и представленных нами результатов следует, что снижение окислительного стресса, вызываемого особенностями каталитических свойств рассматриваемой системы МАО – АлДГ, возможно путем нахождения  возможных активаторов АлДГ. Недавно опубликовано сообщение о таком  химическом соединении–    Alda-1 [Zhong et al., 2015]. Работы в этом направлении крайне желательны, в том числе по оверэкспрессии соответствующих генов. При ротенон-чувствительном апоптозе в модели паркинсонизма показан нейропротекторный эффект увеличенной активности альдегиддегидрогеназы. Оверэкспрессия соответствующего гена уменьшает ротенон-чувствительную гибель клеток [Chiu et al., 2015].

Выводы.

1.    Ингибиторы АлДГ, АДГ и КО - 4-метилпиразол, тетурам и аллопуринол повышают количество 4- оксифенилацетальдегида, образовавшегося под действием МАО.

2.    Отмечены особенности недостатка активности ферментов распада альдегидов в сочетании со слабым ингибированием продуктом реакции МАО по типу обратной связи.

Список литературы

1.     Бузинова Е.В., Доведова Е.Л.., Москвитина Т.А., Ашмарин И.П. Влияние активной иммунизации к аминоксидазе плазмы на мнестические процессы и состояние медиаторных систем мозга крыс. Бюлл.эксп. биол. Мед., 1998,126(7), c. 39-42.

2.     Данилова Р.А.,Белопольская М.В., Кушнир Е.А., Москвитина Т.А.. Афанасьев И.И., Андяржанова Э.А., Обухова М.Ф., Шевченко В.П., Ашмарин И.П. Долговременное изменение биохимического и физиологического статуса белых крыс иммуномодуляцией активности МАО. Нейрохимия, 17(3), c. 192- 197, 2000.

3.     Пеккель В.А., Аксенова Л.Н., Боймирсаев В.И. Модифицированный радиометрический метод определения аминоксидазной активности, пригодный для анализа аминоксидазных тромбоцитов в микродозах цельной крови. Лаб.дело, 7, c. 491-497, 1987.

4.     Холмина И.В., Горкин В.З. Окисление жирноароматических альдегидов в ткани печени. Вопр. мед. хим.25(3), c. 322-328, 1979.

5.     Chiu C.C., Yeh T.H., et.al. Neuroprotective effects of aldehyde dehydrogenase 2 activation in rotenone-induced cellular and animal models of parkinsonism. Exp. Neurol., 263 p.244-245, 2015.

6.     Goldstein D.S., Sullivan P. Rotenon decreases intracellular aldehyde dehydrogenase activity. Implication for pathogenesis of Parkinson Disease. J. Neurochem., 133(1), p.14-25, 2015.

7.     Kaludercic N., Mialet-Perez J., et.al. Monoamine oxidases as sources of oxidants in the heart. J Mol Cell Cardiol.73 p.34-42, 2014.

8.     Pathak A., Srivastava A.K., Singour P.K., Gouda P. Synthetic and natural monoamine oxidase inhibitors as potential lead compounds for effective therapeutics. Cent Nerv Syst Agents Med Chem. 2015.

9.     Zhong R.Z., Fang Y., Qin G.X., Li H.Y., Zhou D.W. Tea catechins protect goat skeletal muscle against H2O2- induced oxidative stress by modulating expression of phase 2 antioxidant enzymes. J Agric Food Chem. 2015.