04 марта 2016г.
Избыток гомоцистеина (ГЦ) в крови является фактором риска атеросклероза, сердечно-сосудистых заболеваний, нейродегенеративных болезней, что доказано как результатами популяционных исследований [6], так и данными экспериментов [7]. В том случае, если концентрация гомоцистеина в крови достигает 15 мкмоль/л и выше, говорят об умеренной гипергомоцистеинемии. Эффект ГЦ связывают с цитотоксическим действием на эндотелий сосудов. Кратковременное воздействие гомоцистеиновой кислоты – метаболита гомоцистеина – на нейроны приводит к апоптозу, а с увеличением концентрации индуцируется некроз вследствие нарушения упаковки и разрыва клеточных мембран [4]. Влияние аминокислоты на эритроциты остается малоизученным.
В связи с этим, целью настоящей работы явилось выяснение мембранотропного влияния малых доз гомоцистеина на эритроциты экспериментальных животных.
Материалы и методы.
Для исследования были выбраны белые беспородные крысы-самцы (Rattus Norvegicus Berk) одного возраста №10. Для получения эритроцитарной массы кровь в объеме 0,5 мл, взятой транскардиально, (требования к гуманному обращению с животными соблюдены) центрифугировали при оборотах центрифуги 3000 об/мин в течение 10 минут. Исследовались контрольные образцы эритромассы и образцы после предварительной инкубации с DL-гомоцистеином в течение 15 минут (Sigma Aldrich, США) в концентрации 5, 10, 15 30 мкмоль/л. В качестве основных параметров, характеризующих резистентность эритроцитов к действию ГЦ использовались: эритрограммы по И.А. Терскову и И.И. Гительзону (1957), относительное содержание фракций эритроцитов с низкой и пониженной (до 180 с), средней (180-270 с) и высокой (более 270 с) устойчивостью к кислоте, индекс резистентности относительных количеств эритроцитов с низкой и пониженной устойчивостью по отношению к эритроцитам со средней и высокой устойчивостью [5]; расчет доли эритроцитов, распавшихся за определенный промежуток времени, скорость гемолиза [3]. Результаты обрабатывались статистически с использованием стандартных программ Excel и Statistica 6.
Результаты и их обсуждение.
Нормальная эритрограмма представляется кривой, соединяющей точки, соответствующие проценту падения оптической плотности раствора в результате гемолиза. При исследовании эритрограмм контрольных (нативных) и подвергнутых воздействию гомоцистеина образцов крови мы получили следующие обобщенные данные. Количество эритроцитов с пониженной устойчивостью к гемолитику достоверно повышается, начиная с дозы 10 мкмоль/л, скорость гемолиза увеличивается, начиная с минимальной дозы ГЦ в 5 мкмоль/л. Полученные результаты свидетельствуют о способности ГЦ усиливать скорость кислотного гемолиза эритроцитов независимо от дозы гомоцистеина. Даже в минимальном количестве этот параметр повышен в 1,46 раз (0, 076±0,02 – контроль, 0,111±0,01 – 5 мкмоль/л, 0,113±0,03 – 30 мкмоль/л, р≤0,05). Однако следует отметить, что латентный период, после которого начинаются первоначальные изменения эритроцитов, имеет тенденцию к укорочению, о чем свидетельствуют низкие начальные параметры гемолиза: 1,45±0,026 (σ=0,058) – контроль, 1,40±0,001 (σ=0,0001) – 5 мкмоль/л, 1,11±0,017 (σ=0,029) – 10 мкмоль/л, 1,28±0,017(σ=0,028) – 15 мкмоль/л, 1,20±0,029 (σ=0,05) – 30 мкмоль/л. По всей видимости, гемолиз начинается в экспериментальных образцах за счет действия ГЦ еще в период инкубации клеток с аминокислотой. Подтверждение полученным в ходе эксперимента данным имеется в работах последних лет, в которых указывается на наличие NMDA-рецепторов на эритроцитах, в т.ч. в эритроцитах крыс с которыми взаимодействует аминокислота. Глутаматные рецепторы активизируют вход ионов кальция внутрь эритроцитов, сморщивание клетки, и изменение внутриклеточного рН [1, 2]. Пик скорости гемолиза, четко выраженный в контрольных образцах крови и приходящийся на 4,0±0,3 минуту, сдвигается на более ранний временной период (2,5±0,5 минуты) и выраженность его сглаживается, о чем свидетельствует снижение коэффициента эксцессии, который достигает отрицательных значений при дозе ГЦ в 30 мкмоль/л. Количество эритроцитов с пониженной устойчивостью к гемолитику увеличивается соответственно дозе ГЦ на: 16,27% (5 мкмоль/л); 47,41% (10 мкмоль/л); 58,69% (15 мкмоль/л) и 57,36% (30 мкмоль/л), в связи с чем снижается индекс резистентности. Наибольший процент гемолизированных эритроцитов в контроле (31,49%) приходится на 4-ю минуту, при концентрации ГЦ 10 мкмоль/л – на 3-ю, при концентрации 15 и 30 мкмоль/л – на 2,5-ю минуту действия гемолитика.
Таким образом, гомоцистеин обладает выраженным мембранотропным действием, увеличивает скорость гемолиза, снижает устойчивость эритроцитов к гемолитическому действию кислоты, в связи с чем снижается индекс резистентности клеток. Эти эффекты проявляются уже в минимальных дозах ГЦ, эквивалентных нормальному содержанию его в крови.
Список литературы
1. Makhro A., Hänggi P., Goede J.S., Wang J., Brüggemann A., Gassmann M., Schmugge M., Kaestner L., Speer O., Bogdanova A. N-methyl-D-aspartate receptors in human erythroid precursor cells and in circulating red blood cells contribute to the intracellular calcium regulation // Am. J. Physiol. Cell Physiol. 2013, Dec 1;305(11):C1123-38. doi: 10.1152/ajpcell.00031.2013. Epub 2013 Sep 18.
2. Makhro A., Wang J., Vogel J., Boldyrev A.A., Gassmann M., Kaestner L., Bogdanova A. Functional NMDA receptors in rat erythrocytes // Am. J. Physiol. Cell Physiol. 2010, Jun; 298(6):C1315-25. doi: 10.1152/ajpcell.00407.2009. Epub 2010 Mar 24.
3. Амбарцумян А.Ф., Сукиасян А.Р., Киракосян А.А. Анализ кинетики гемолиза с применением центральных моментов случайного распределения // Биолог. журн. Армении, №4 (60), 2008, с. 56-60.
4. Болдырев А.А. Молекулярные механизмы токсичности гомоцистеина // Биохимия, 2009, Т.74, вып.6, с.725- 736.
5. Голенда И.Л. Голенда А.И. Иванов В.И. Минин В.В. Драпезо Р.Г. Макрушин И.М. Овчинникова О.В. Способ определения функционального состояния организма по степени резистентности крови к кислотному гемолизу // Патент на изобретение РФ No2179315 от 10.02., 2002. RU 2179315.
6. Никитин Ю.П., Мотина О.В., Рагино Ю.И., Симонова Г.И., Полонская Я.В., Иванова М.В., Щербакова Л.В., Малютина С.К. Гипергомоцистеинемия в мужской популяции Новосибирска // Российский кардиологический журнал, 2007, № 4, с.63-69.
7. Чучкова Н.Н. Глумова В.А. Сметанина М.В. Кормилина Н.В. Иммуноэндокринные взаимодействия в условиях формирования гомоцистеиновой модели атеросклероза // Российский иммунологический журнал, 2013, Т.7, № 2-3, с. 301.
