05 января 2016г.
Введение
Диметилсульфоксид (ДМСО) и диметилкетон (ацетон) – биполярные апротонные растворители, имеющие внешнее структурное сходство молекул, что представлено на Рисунке 1.
Рис.1. Структурные формулы молекул действующих веществ: А – ДМСО; Б - ацетон
Они имеют широкое применение в быту, различных областях химии, а также в медицине (ДМСО) в качестве растворителей труднорастворимых фармакологических веществ [11, 13, 16, 17]. Но всегда возникает вопрос: а не оказывают ли они неблагоприятного воздействия на биологические объекты, а если оказывают, то в каких концентрациях? В литературе можно встретить сведения о том, что использование ДМСО в растворах безопасно вплоть до 5–10% по объему (600–1200 мМ), а ацетона – до 0,1–0,25% (16,7–41,7 мМ). Ацетон является естественным метаболитом организма человека и животных. В нормальных условиях его содержание в сыворотке крови человека не превышает 6 мг/л (0,1 мМ). Токсическая концентрация в крови – 200–300 мг/л (3,3–5,2 мМ), смертельная – 550 мг/л (9,5 мМ) [11].
В связи с тем, что конкретных сведений об изменениях электрофизиологических параметров функционального состояния нейронов под влиянием ДМСО и ацетона в литературе мы не обнаружили, то представляется актуальным изучение влияния ДМСО и ацетона в концентрациях 100–1000 мМ на электрическую активность нейронов, что и явилось целью данного исследования.
Методика исследования
Микроэлектродные исследования выполнены на наиболее крупных (100–200 мкм) идентифицируемых нейронах педальных и висцерального ганглиев изолированной ЦНС моллюска катушки роговой (Planorbariuscorneus). Нейроны в ганглиях данного моллюска пигментированы и лучше видны под бинокулярной лупой, чем нейроны прудовика или виноградной улитки. Из тела моллюска вырезали кольцо ганглиев и помещали в камерку объемом около 0,5 см3 с физиологическим раствором(в мМ/л): NaCl – 50; KCl – 2; CaCl2 –4; MgCl2 – 1,5; трис-ОН – 10; рН – 7,5. Для регистрации электрофизиологических характеристик нейронов использовали стеклянные МЭ, заполненные 2,5 МKCl, с сопротивлением 10–20 мОм [1, 2, 8]. Измерения ионных токов при фиксации потенциала проведены на изолированных неидентифицированных нейронах с диаметром около 100 мкм.
ДМСО и ацетон растворяли в физиологическом растворе до концентраций 100, 200, 400, 500, 600, 800 и 1000 мМ. При внеклеточном приложении веществ изучали динамику изменений потенциала покоя (ПП), импульсной активности (ИА), параметров потенциалов действия (ПД) и суммарных ионных токов, оцениваемых по первой производной ПД. Биопотенциалы регистрировали с помощью аналого-цифрового преобразователя фирмы «L-Card» L-791 (Россия).
Результаты исследования
Исходные величины ПП для разных нейронов катушки варьировали (среднее значение 55,2±5,9 мВ; n = 15), они генерировали ПД с «овершутом» амплитудой от 50 до 90 мВ. Некоторые нейроны были молчащими, а также с различным характером ИА: регулярной или нерегулярной, одиночной либо пачечной. Большинство результатов получено на импульсноактивных (ИА) нейронах педальных ганглиев.
Под влиянием ДМСО и ацетона происходили зависимые от концентрации гипер- и деполяризационные изменения ПП с соответствующими изменениями ИА, параметров ПД и скоростей развития ПД (dV/dt, отражающих суммарные входящие и выходящие ионные токи). Эффекты от обоих веществ стабилизировались через 2–3 мин от начала действия, были обратимы и с гиперполяризующим последействием в течение 5–15 мин. На фоне незначительных изменений ПП перестройка ИА нейронов была разнообразной, что зависело от их типа, величины ПП (уровня функционального состояния), характера фоновой ИА и концентраций веществ.
Реакции нейрона на приложение ДМСО представлены на Рисунок 2-3.
Рис.2. Изменения электрической активности нейронакатушки левого педального ганглия (ЛПед1) под влиянием ДМСО в различных концентрациях, где:
1 – контроль, 2 – 500 мМ ДМСО, 3 – 1000 мМ, 4 – отмывание; А – изменения ПП, ИА и амплитуды ПД; Б– изменения суммарных ионных токов (dV/dt, вверх – входящие натрий-кальциевые, вниз – выходящие калиевые); перерывы в записях – уровень 0 мВ и начало смены растворов. Калибровка dV/dt на врезках (Б, 2–4): по вертикали –5 В/с, по горизонтали – 5 мс.
На нейроне левого педального ганглия (ЛПед1) с пачечной активностью были зарегистрированы реакции на ДМСО в концентрации 500 мМ, амплитуда у ПД нейрона не изменялась, но увеличивалась длительность генерации пачек ПД, а в концентрации 1000 мМ нейрон обратимо деполяризовался, перестраивался характер ИА – увеличивалась частота и снижалась амплитуда ПД (Рисунок 2, А, 3). При отмывании от ДМСО наблюдалась небольшая (до 5–7 мВ) гиперполяризация нейрона (Рисунок 2, А, 4). Повторное действие ДМСО на этом же нейроне было сходным. Регистрация суммарных ионных токов (dV/dt) показала, что их изменения более выражены (Рисунок 2, Б), чем изменения амплитуд ПД, и уменьшение амплитуд токов примерно на 10% были уже под влиянием ДМСО в концентрации 500 мМ (Рисунок 2, Б, 2). Они усиливались при действии ДМСО в концентрации 1000 мМ (Рисунок 3, Б, 3), доходя до 20–25%. На фоне увеличения частоты ИА длительность ПД возрастала (Рисунок 2, Б, 3 – врезка dV/dt). При отмывании амплитуда и длительность токов восстанавливались, амплитуда ПД превышала контрольные величины (Рисунок 2, Б, 4), а частота ИА на фоне гиперполяризации, как и в предыдущем эксперименте, снижалась до исходной.
Более выраженные реакции нейрона на приложение ДМСО представлены на Рисунке 3.
Рис.3. Изменения электрической активности нейроновкатушки правого педального ганглия под влиянием ДМСО в различных концентрациях
Изменения ПП, ИА и амплитуды ПД; гиперполяризация нейрона после действия ДМСО в концентрации 1000 мМ; горизонтальная черта – уровень 0 мВ, вертикальные черточки на записях – начало смены растворов.
На Рисунке 3 видна слабая реакция при действии концентрации 500 мМ, но более сильное подавление амплитуды ПД при 1000 мМ и гиперполяризация нейрона при значительном урежении ИА в процессе отмывания. Следует еще отметить, что довольно часто на нейронах с низким уровнем ПП влияние ДМСО, как и других фармакологических средств, бывает более сильным. Так на нейронах, исходно имевших низкий уровень ПП (около –45 мВ) под влиянием ДМСО в концентрации 1000 мМ на фоне сильной деполяризации ИА прекращалась, но при отмывании она медленно восстановилась практически до исходных ее параметров.
На Рисунке 4 представлена реакция нейрона на ацетон.
Рис.4. Влияние ацетона в различных концентрациях на электрическую активность нейронов катушки роговой
А – динамика изменений ПП, ИА и амплитуд ПД на нейроне левого педального ганглия ЛПед1: 1 – контроль, 2 – ацетон 100 мМ, 3 – отмывание, 4 – 600 мМ, 5 – отмывание, 6 – 1000 мМ, 7 – отмывание; Б – развертка во времени фрагмента ИА и ионных токов в контроле (А, 1); В – развертка во времени фрагмента действия ацетона (А, 2), увеличение частоты ПД и снижение токов.
В сравнении с ДМСО влияние ацетона на электрическую активность нейронов было заметным уже при концентрации 100 мМ (Рисунок 4, А, 2), а в концентрациях 600 и 1000 мМ – ИА полностью, но обратимо подавлялась (Рисунок 4, А, 4 и 6). На фоне деполяризации наблюдалось зависимое от концентрации увеличение частоты ПД, снижение их амплитуд и суммарных ионных токов (Рисунок 4, В).
На Рисунок 5 показан результат регистрации изменения ионных токов при воздействии ДМСО и ацетона.
Рис.5. Изменения калиевых ионных токов нейронов катушки под влиянием ДМСО и ацетона А – ДМСО: 1 – контроль, 2 – 600 мМ, 3 – 800, 4 – 1000, 5 – отмывание; Б – ацетон: 1 – контроль, 2 – 100 мМ, 3 – 200, 4 – 400, 5 – 600, 6 – отмывание.
Регистрация ионных токов на изолированных нейронах показала, что их изменения под влиянием ДМСО в концентрациях 600, 800 и 1000 мМ были весьма незначительными, это наблюдалось как для входящих натрий- кальциевых токов, так и для калиевых (Рисунок 5, А, 2-4). После действия ДМСО амплитуда тока даже незначительно возрастала (Рисунок 5, А, 5). Под влиянием ацетона в концентрациях 100, 200, 400 и 600 мМ уменьшение амплитуд токов были более сильным (Рисунок 5, Б, 2-5), также обратимым и после его действия несколько увеличенным (Рисунок 5, Б, 6). Если сравнивать степень снижения амплитуды ПД (Рисунок 4, А, 4 и 6) и амплитуды ионных токов (Рисунок Рисунок 5, Б, 5) под влиянием ацетона в концентрации 600 мМ, то можно видеть, что ионные токи были снижены не полностью (в меньшей степени), а амплитуда ПД была подавлена полностью. Это указывает на то, что под влиянием ацетона уменьшение амплитуды ПД нейронов обусловлено в большей степени их деполяризацией и в меньшей – подавлением ионных токов. Влияние же ДМСО на ПД было обусловлено примерно в равной степени изменениями ПП и модуляцией ионных токов.
Обсуждение результатов
Полученные данные об отсутствии существенного влияния на нейроны моллюска апротонных растворителей ДМСО и ацетона, имеющих структурное сходство молекул, в диапазоне концентраций до 100 мМ и об изменениях ПП при действии или после действия (зависимая от концентрации гипер- и деполяризация) и соответствующих изменениях параметров ПД, суммарных ионных токов и ИА под их влиянием только в диапазоне высоких концентраций 200–1000 мМ убедительно свидетельствуют об относительной безопасности использования этих веществ в качестве растворителей фармакологических средств. При этом меньшее повреждающее действие на нейроны оказывает ДМСО. Если сравнивать эффекты ацетона, вызываемые им у человека и на нейронах моллюсков, то можно констатировать меньшую чувствительность (в 5–10 раз) последних к нему. Так, ацетон вызывал анестезию головастиков (EC50=264±2 мM), на нейронах лягушки в концентрации 50 мM он увеличивал амплитуду ответов рецепторов GABAA, в концентрации 100 мM и выше подавлял ионные токи каналов, связанных с рецепторами TRESK, а в концентрации 200 мM и каналов рецепторов NMDA [17].
На основании полученных данных о том, что после действия растворителей наблюдается и гиперполяризация нейронов, и увеличение амплитуд регистрируемых токов, пока нельзя говорить о каком-либо положительном или стимулирующем их влиянии на нейроны. Концентрации 200–1000 мМ примерно соответствуют 4 и 8%-ным растворам ДМСО, при этом они увеличивают тоничность раствора для моллюсков на 300–700%. И это свидетельствует о высокой резистентности данных нейронов к изменениям наружных растворов. Таким образом, в экспериментальных исследованиях на биологических объектах вполне оправдано и безопасно использование ДМСО в качестве растворителя фармакологических средств в диапазоне концентраций до 100–500 мМ, и ацетона – до 100 мМ.
Деполяризация клеточных мембран может быть связана с изменениями пассивной проницаемости клеточных мембран к ионам натрия и калия, а гиперполяризация после действия ДМСО – с обезвоживанием нейронов, с увеличением внутриклеточной концентрации ионов натрия и с активацией работы электрогенного натрий-калиевого насоса [13, 16].
Изменения суммарных ионных токов, параметров ПД и ИА нейронов под влиянием ДМСО и ацетона, скорее всего, обусловлены соответствующими изменениями ПП и в меньшей степени их можно связать с прямым влиянием на потенциалоуправляемые ионные каналы или хемоуправляемые каналы синаптических и пейсмекерных структур [8, 9, 10, 12, 14, 15].
Список литературы
1. Вислобоков А.И., Игнатов Ю.Д., Галенко-Ярошевский П.А., Шабанов П.Д.Мембранотропное действие фармакологических средств. Санкт-Петербург – Краснодар: Просвещение-Юг, 2010.
2. Вислобоков А.И., Игнатов Ю.Д., Середенин С.Б. Изменения электрической активности нейронов под влиянием афобазола // Экспериментальная и клиническая фармакология. 2012. Т. 75. № 6. С. 3–7.
3. Камкин А.Г., Киселева И.С. Физиология и молекулярная биология мембран клеток: учеб.пособие. М.: Издательский центр "Академия", 2008.
4. Орлов В.И., Ласков В,Н., Карпенко Л.Д. Способ препаровки центральной нервной системы виноградной улитки // А.с. № 1561962, 1990.
5. Орлов В.И., Вислобоков А.И., Шурыгин А.Я., Карпенко Л.Д. Об изменениях биопотенциалов и ионных токов под влиянием препарата бализ-2. // Вестник СПбГУ. 1992. В.4. №24. С. 49-51.
6. Орлов В.И., Сердюк Т.С., Сухов А.Г. Внутриклеточные и внеклеточные исследования роли пейсмекерных потенциалов в организации осциляторнойактивности.// В: XVI Международная конференция по нейрокибернетике. 2012. С. 117-120
7. Орлов В.И., Сердюк Т.С., Анисимова В.А., Сухов А.Г. Нейрохимические механизмы регуляции ритмогенеза мозга в норме и патологии. // В: XXII Съезд физиологического общества имени И,П. Павлова: тезисы докладов. Волгоград: ВолгГМУ, 2013. С.396
8. Вислобоков А.И., Борисова В.А., Прошева В.И., Шабанов П.Д. Фармакология ионных каналов / Серия: Цитофармакология. Т. 1. СПб.: Информ-Навигатор, 2012.
9. Ashcroft F.M. Ion channels and disease. Academic Press, San Diego, 2000.
10. Camerino D.C., Tricarico D., Desaphy J.F. Ion channel pharmacology // Neurotherapeutics. 2007. Vol. 4 (2). P. 184–198.
11. Http://www.himdetrit...emtech/102/103/
12. Hübner C.A., Jentsch T.J. Ion channel diseases // Hum. Mol. Genet. 2002. Vol. 11.P. 2435–2445.
13. Larsen J., Gasser K., Hahin R.An analysis of dimethylsulfoxide-induced action potential block: a comparative study of DMSO and other aliphatic water soluble solutes //Toxicol. Appl. Pharmacol. 1996. Vol. 140 (2). P. 296– 314.
14. Narahashi T.Neuroreceptors and ion channels as the basis for drug action: past, present, and future // J. Pharmacol. Exp. Ther. 2000. Vol. 294 (1). P. 1–26.
15. Ragsdale D.S., McPhee J.C., Scheuer T., Catterall W.A. Common molecular determinants of local anesthetic, antiarrhythmic, and anticonvulsant block of voltage-gated Na+ channels // Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 1996. Vol. 93. P. 9270–9275.
16. Santos N.C., Figueira-Coelho J., Martins-Silva J., Saldanha C. Multidisciplinary utilization of dimethyl sulfoxide: pharmacological, cellular, and molecular aspects // Biochem. Pharmacol. 2003. Vol. 65 (7). P. 1035–1041.
17. Yang L., Zhao J., Milutinovic P.S., Brosnan R.J., Eger E.I., Sonner J.M. Anesthetic properties of the ketone bodies beta-hydroxybutyric acid and acetone //Anesth. Analg. 2007. Vol. 105 (3). P. 673–679.
