АНАЛИЗ ЦИРКУЛИРУЮЩИХ МИКРОЧАСТИЦ ПЛАЗМЫ КРОВИ МЕТОДОМ ПРОТОЧНОЙ ЦИТОМЕТРИИ

Микрочастицы (микровезикулы) - это сферические структуры, окруженные липидным бислоем, которые секретируются с поверхности различных клеток в межклеточное пространство содержат все компоненты клеточной мембраны характерные для выпускающей их клетки. Микрочастицы обнаружены во всех жидкостях организма, таких как кровь, моча, слюна, грудное молоко (Cocucci E., 2009, Taylor D., 2008), что делает их потенциальным источником биомаркеров для диагностики, прогнозирования заболеваний и мониторирования различных состояний  организма. Увеличение концентрации микрочастиц в крови больных при различных патологических состояниях подтверждает мнение, что микрочастицы играют роль в патогенезе и развитии заболеваний, в том числе различных видов рака, инфекционных заболеваний, аутоиммунных заболеваний, тромбоэмболических осложнений и других (Manshouri T., 2003; Ghosh A.K., 2010; Oehmcke S., 2012). Тем не менее, большинство из этих исследований являются наблюдательными и, возможная роль микрочастиц, как прогностических биомаркеров в стратификации групп риска заболевания, только начинает решаться. Интерес, возникший в последние годы к изучению микрочастиц, выделяемых различными типами клеток, требует формирования новых методических подходов. Ряд методов, используемых в данном направлении, включает проточную цитометрию, ELISA, а также новые технологии Fluorescent Nanoparticle Tracking Analysis (FNTA) (Dragovic R.A., 2011). Поскольку на микрочастицах присутствуют такие же поверхностные антигены, как и на родительских клетках, иммунофенотипирование микрочастиц методом проточной цитометрии, на данный момент, является наиболее используемым методом для их характеристики (Orozco A.F., 2010). В нашей работе методом проточной цитометрии мы исследовали микрочастицы плазмы крови В-лимфоцитарного происхождения с помощью CD20 и CD19 антигенов, являющихся основными маркерами для фенотипирования В-лимфоцитов.

Выделение микрочастиц из плазмы крови

При исследовании микрочастиц определяющее значение имеет способ их выделения (Dey-Hazra E., 2010). В настоящее время центрифугирование является одним из основных методов выделения микрочастиц из плазмы крови, но на данный момент не существует единого стандартного протокола выделения. Мы модифицировали имеющиеся протоколы под наши задачи. Кровь в количестве 5 мл забиралась у доноров, центрифугировали 20 минут при 2500g. Полученную плазму центрифугировали еще раз при тех же условиях. Затем 0,5 мл плазмы центрифугировали при 13000g в течение 40 минут при 4°С для осаждения микрочастиц. К осадку добавляли 1 мл фосфатно-солевого буфера и центрифугировали повторно. Полученный осадок разводили в 0.5 мл фосфатно- солевого буфера и использовали для анализа.

Анализ микрочастиц с помощью проточной цитометрии

На данный момент основным методом, использующимся для характеристики циркулирующих микрочастиц, является метод проточной цитофлуориметрии. Несмотря на это, не существует стандартных протоколов для их определения. Этот метод позволяет определить относительный размер (прямое светорассеяние, FСS) и относительную гранулярность (боковое светорассеяние SSС) частиц. Поскольку в настоящее время нет консенсуса по пороговому значению (значение, характеризующее минимальный размер микрочастиц, который возможно детектировать с помощью проточного цитометра) мы определяли пороговый уровень по фоновому шуму. Фоновый шум определялся по числу событий при дважды фильтрованном (фильтр 0,22 мкм) фосфатно-буферном растворе (Рисунок 1А). Для определения относительного размера микрочастиц были использованы стандартные калибровочные бусы 0,3 мкм, 1,1 мкм, 2 мкм и 3 мкм, с помощью которых выставлялись ворота для определения диапазона исследуемых частиц (рисунок 1Б). Исходя из литературных данных, размер микрочастиц определяется в диапазоне 0,2-2 мкм, кроме того, предел чувствительности проточного цитометра не позволяет определять везикулы менее 0,3 мкм.

Чтобы оценить микрочастицы плазмы крови В-лимфоцитарного происхождения мы использовали CD20 и CD19 маркеры, являющиеся основными для фенотипирования В-лимфоцитов. Для окрашивания антителами по 30 мкл микрочастиц раскапывали в 96-луночный планшет, добавляли по 3 мкл CD20-PE, CD19-FITC (фирма) антител или изотипический контроль, инкубировали 30 мин, переносили в  центрифужные пробирки, затем добавляли 2 мл фосфатно-солевого буфера и центрифугировали при 13000g. Полученный осадок разводили в 0,5 мл фосфатно-солевого буфера и анализировали на проточном цитометре FACSCanto II (BD Biosciences). Для иммунофенотипирования лимфоцитов использовали стандартную методику лизиса эритроцитов с последующим центрифугированием. Иммунофенотипирование лимфоцитов проводили  по стандартному протоколу фирмы- производителя антител.

В нормальной плазме, большинство микрочастиц (до 80%), происходят из тромбоцитов, в то время как остальные происходят из эндотелия и лейкоцитов (Caby M.P., 2005). В таблице 1 представлены результаты оценки экспрессии CD19 и CD20 поверхностных антигенов одновременно на лимфоцитах и на микрочастицах у пяти доноров.

Таблица 1 Процент содержания CD19 и CD20-позитивных микрочастиц и лимфоцитов в плазме крови здоровых доноров.

Процент везикул В-лимфоцитарного происхождения у здоровых доноров составляет менее 5%, за исключением одного донора у которого обнаружено 15% CD19 и 7% CD20-положительных микрочастиц. Как мы видим из таблицы, это не связано с количеством CD19 и CD20-позитивных лимфоцитов, остающихся в пределах нормы. Вероятно, увеличение количества микрочастиц В-лимфоцитарного происхождения у данного донора связано с усилением их образования на поверхности клеток. Такая же закономерность выявлена в работе (Domnikova N.P., 2013) у больных хроническим лимфолейкозом, где у некоторых больных количество лимфоцитов достигает 90%, однако, это не приводит к увеличению количества микрочастиц, несущих CD19 и CD20 антигены. Кроме, того в работе (Ghosh A.K., 2009) также не выявлено корреляции между количеством лимфоцитов и количеством CD19 и CD20-положительных микрочастиц. Вариации количества микрочастиц могут быть вызваны как физиологическими причинами, так и быть следствием патологического процесса или лекарственного воздействия (Barteneva N., 2013). Следует также отметить, что процент CD19-положительных микрочастиц больше, чем CD20, и это согласуется с распределением CD19 и CD20 антигенов на лимфоцитах. Кроме того, микрочастицы, так же как и лимфоциты, имели двойное CD20 и CD19 позитивное окрашивание (Табл.1.), что является подтверждением происхождения этих везикул из В-клеток лимфоцитов.

Таким образом, в нашей работе было проведено исследование микрочастиц, плазмы крови, с помощью проточного цитометра и продемонстрировано наличие у здоровых доноров CD20 и CD19-положительных микрочастиц В-лимфоцитарного происхождения.

Список литературы

1.     Barteneva N.S., Fasler-Kan E., et. al. BMC Cell Biol. 2013, Apr 22; 14:23.

2.     Cocucci E., Racchetti G., Meldolesi J. Trends Cell Biol. 2009, Feb;19(2):43-51.

3.     Dey-Hazra E., Hertel B., et. al. Vasc Health Risk Manag. 2010, Dec 6;6:1125-33.

4.     Domnikova N.P., Dolgikh T.Y., et al. Bull Exp Biol Med. 2013. Nov;156(1):94-7.

5.     Dragovic R.A., Gardiner C., et. al. Nanomedicine. 2011, Dec;7(6):780-8.

6.     Ghosh A.K., Secreto C.R., Knox T.R., et. al. Blood. 2010, Mar 4;115(9):1755-64. 7. Manshouri T., Do K.A., Wang X., еt. al. Blood. 2003, Apr 1;101(7):2507-13.

8.     Michel R.B., Mattes M.J. Br J Cancer. 2004, Oct 18;91(8):1500-7.

9.     Nomura S., Inami N., Ozaki Y., Kagawa H., et al. Platelets 2008, 19: 192-198.

10. Oehmcke S., Mörgelin M., et. al. Cell Microbiol. 2012, Jan;14(1):107-19.

11. Orozco A.F., Lewis D.E., et. al. Cytometry. 2010, Jun;77(6):502-14.