31 марта 2018г.
Среди протеолитических ферментов особое внимание привлекает коллагеназа – эндопептидаза, расщепляющая тройную спираль молекулы нерастворимого природного белка коллагена [1]. Коллагеназа может найти широкое применение во многих областях медицины [2-6]: в хирургии (изъязвления, некрозы, варикозные язвы, хронический остеомиелит, посттравматические деформации), терапии (системные заболевания соединительной ткани, воспаления и тромбозы, ларингиты, бронхиты, абсцессы), гинекологии (аднекситы, маститы, эрозии), стоматологии, а также в косметологии (антивозрастные косметические средства). Ранее нами было показано, что ряд микромицетов из биоколлекции ФГБНУ ВИЛАР секретируют в культуральную жидкость протеиназы с различной субстратной специфичностью, которые были выделены и охарактеризованы [7-9]. В то же время поиск новых продуцентов остается в настоящее время достаточно актуальной задачей. Для решения подобных задач широко используются различные скрининг-методы [10, 11]. В связи с этим целью настоящего исследования являлось изучение коллагенолитической активности микромицетов из биоколлекции ФГБНУ ВИЛАР.
Материалы и методы
В работе использовали следующие коллекционные штаммы: Aspergillus sedowii (F-25), A. terreus (F-59), Penicillium casei (F-19) и P. purpurescens (F-18). Культуры микромицетов выращивали на скошенной поверхности агаризованной среды Чапека следующего состава (%): NaNO3 – 0,2; KH2PO4 - 0,1; MgSO4 x 7H2О – 0,05; KCl – 0,05; FeSO4x 7H2O – 0,001; CaCO3 – 0,3; сахароза – 2; агар – 2, (рН 6,8) в течение 7-ми суток при 260С. Для проведения поверхностного культивирования использовали агаризованные среды, содержащие солевой фон среды Чапека с заменой сахарозы на 2% нативного коллагена. Протеолитическую активность микроорганизма оценивали по диаметру колоний после посева микромицета на агаризованную среду. Периодически осуществляли замер диаметра колоний и зон лизиса в двух перпендикулярных направлениях. Активность биосинтеза ферментов оценивали по индексу лизиса субстратов, определяемому соотношением площади лизиса к площади колонии по следующей формуле: I лиз = R2лиз /R2кол, где Rлиз – радиус зоны лизиса, Rкол – радиус колонии.
Результаты и обсуждение
Известно, что рост микроорганизмов на субстратах, содержащих белки в качестве единственного источника углерода, позволяет судить об их потенциальной протеолитической активности. Появление зон лизиса белков вокруг колоний является показателем секреции ферментов в окружающую среду. В связи с этим на первом этапе исследования фиксировались диаметры колоний и диаметры зон лизиса при культивировании микромицетов на средах с заменой сахарозы на коллаген (табл. 1). Можно видеть, что все изученные микромицеты росли на средах с коллагеном и образовывали зоны лизиса. На модифицированной среде ранний рост и появление зон лизиса отмечалось у A. sydowii F-25 и A. terreus F-59, P. casei F-19 и P purpurescens F-18 образовывали видимые колонии позже на 1 и 2 дня соответственно. Последняя культура практически на всех этапах культивирования росла медленнее остальных. Микромицет A. terreus, у которого на 3 сутки культивирования отмечалась максимальная скорость роста, затем до 7 суток рос медленно, отставая от A. sydowii и P. casei. К 10 суткам культивирования наибольший размер колоний наблюдался у P. casei.
Таблица 1
Параметры роста микромицетов на средах с заменой сахарозы на коллаген
|
№ штамма
|
Время культивирования, сутки
|
|
3
|
4
|
5
|
6
|
7
|
10
|
|
Dк,
мм
|
Dл,
мм
|
Dк,
мм
|
Dл,
мм
|
Dк,
мм
|
Dл,
мм
|
Dк,
мм
|
Dл,
мм
|
Dк,
мм
|
Dл,
мм
|
Dк,
мм
|
Dл,
мм
|
|
25
|
3,8
|
7,3
|
11,8
|
19,0
|
17,8
|
28,7
|
25,0
|
36,5
|
26,2
|
43,2
|
25,6
|
50,5
|
|
59
|
5,2
|
6,5
|
6,5
|
8,7
|
6,8
|
9,7
|
7,6
|
13,3
|
19,6
|
27,6
|
25,7
|
43,2
|
|
19
|
рн
|
|
3,2
|
12,2
|
10,8
|
22,8
|
30,8
|
36,2
|
38,5
|
44,3
|
45,0
|
45,3
|
|
18
|
рн
|
|
рн
|
|
3,5
|
4,9
|
5,5
|
7,4
|
9,5
|
11,6
|
11,2
|
12,4
|
Примечание: Dк –– диаметр колоний; Dл – диаметр зон лизиса, рн – роста нет.
Необходимо отметить, что на всех этапах культивирования микромицетов при наличие визуального роста колонии обнаруживались отчетливо видимые зоны лизиса коллагена. При этом, в процессе роста колоний отмечается заметное увеличение диаметров зон лизиса. Исключение составляет P. casei, у которого на последних этапах культивирования рост колоний не сопровождается ростом зон лизиса.
Наряду с такими параметрами роста микроорганизмов, как диаметр колоний и зон лизиса, важным показателем является индекс лизиса. Индекс лизиса определяется соотношением площади колонии и площади зоны лизиса и характеризует удельную протеолитическую активность культуры, так как площадь колонии пропорциональна ее биомассе, а площадь зоны лизиса – активности секретируемых протеиназ. В связи с этим на следующем этапе исследования были рассчитаны индексы лизиса микромицетов при росте на средах, содержащих коллаген (табл. 2).
Можно видеть, что большинство индексов лизиса находится в диапазоне от 1 до 4,5. Исключение составляет индекс лизиса коллагена у P. casei, который был равен 14,5 на 4 сутки культивирования, однако затем он значительно снижался, достигая на последних этапах единицы. Следует отметить, что для трех исследованных культур максимальные индексы лизиса фиксировались на первых этапах роста колоний. Средние индексы лизиса, рассчитанные за все время наблюдения, менялись в следующем ряду P. casei > A. sydowii > A. terreus > P purpurescens.
Таблица 2
Индексы лизиса микромицетов на средах с заменой сахарозы на коллаген
|
№ штамма
|
Время культивирования, сутки
|
|
3
|
4
|
5
|
6
|
7
|
10
|
|
25
|
3,7
|
2,6
|
2,6
|
2,1
|
2,7
|
3,8
|
|
59
|
1,6
|
2,3
|
2,0
|
3,1
|
2,0
|
2,8
|
|
19
|
|
14,5
|
4,5
|
1,4
|
1,3
|
1
|
|
18
|
|
|
1,9
|
1,8
|
1,5
|
1,2
|
Выводы
1.Все исследованные штаммы микромицетов можно рассматривать в качестве потенциальных продуцентов коллагеназ.
2 .Наименьшим коллагенолитическим потенциалом обладает P purpurescens, как по показателю скорости роста, так и по индексу лизиса.
3.Из остальных трех штаммов наибольший интерес представляют A. sydowii и A. terreus, для которых характерна стабильная коллагенолитическая активность на всех этапах культивирования.
Список литературы
1.Можина Н.В., Руденская Г.Н. Коллагенолитические ферменты патогенных микроорганизмов. // Биомедицинская химия – 2004. – Т. 50, № 6. – С. 539-553
2. Alster N.S., Tansi E.L. Hypertrophic scars and keloids: etiology and management. // Am. J. Clin. Dermatol. – 2004. – V. 4, № 4. – P. 39-42
3. utalir S. Treatment of keloids and hypertrophic scars. // Indian J. Dermatol. Venereol. Leprol. – 2005. - V. 71, № 1. – P. 3-8
4. Peled Z.V., Phelbs E.D.,Updike D.L. Matrix metalloproteinases and the ontogeny of scarless repair: the other side of the wound healing balance. // Plast. Reconstr. Surg. – 2002. – V. 110, № 3. – P. 808-811 5.Neely A.N., Clendening C.E., Gardner J. Gelatinase activity in reloads and hypertrophic scars. // Wound Repair Regen. – 1999. – V. 7, № 3. – P. 166-171
6.Friedman K., Pollack S.V., Manning T., Pinnell S.R. Degradation of porcine dermal connective tissue by collagenase and hyaluronidase. // Br. J. Dermatol. – 1986. – V. 115, № 4. – P. 403-408
7. Сухосырова Е.А., Яковлева М.Б., Никитина З.К., Быков В.А. Секреция коллагенолитических ферментов некоторыми видами дейтеромицетов. // Технология живых систем - 2007. - Т. 4, № 4. - С. 29-33
8 .Никитина З.К., Гордонова И.К. Некоторые свойства кератинолитического фермента, секретируемого Cladosporium sphaerospermum. // Вопросы биол., мед. и фарм. химии -. 2011. - № 5. - С. 36-40
9 .Никитина З.К., Гордонова И.К. Выделение, очистка и биохимические свойства кератинолитического фермента, секретируемого Penicillium citrinum. // Вопросы биол., медицинской и фармацевтической химии – 2013. - № 9. - С.36-41
10 .Яковлева М.Б., Никитина З.К. Скрининг-методы в биотехнологии (Обзор). Часть 1. Поиск микроорганизмов-продуцентов ферментов. // Вопросы биол., медицинской и фармацевтической химии - 2016. - № 4. - С. 23-32
11 .Яковлева М.Б., Никитина З.К. Скрининг-методы в биотехнологии (Обзор). Часть 1I. Поиск микроорганизмов-продуцентов биологически активных веществ. // Вопросы биол., медицинской и фармацевтической химии - 2016. - № 5. - С. 35-43
