10 марта 2016г.
Метилотрофные дрожжи Pichia pastoris успешно используют для получения различных эукариотических белков. Основными преимуществами систем экспрессии на основе дрожжей Р. pastoris являются способность осуществлять посттрансляционные модификации, характерные для высших эукариот, быстрый рост и накопление большой биомассы, относительная простота работы со штаммами-продуцентами (Cereghino et al., 2002).
Одним из основных факторов, определяющих уровень продукции рекомбинантных белков, является их стабильность и устойчивость к деградации. Гетерологичные белки могут расщепляться протеазами, участвующими в процессинге секреторных белков, а также протеазами, секретируемыми в культуральную жидкость (Boehm et al., 1999; Werten et al., 1999; Shapiro et al., 2003).
Ранее кДНК структурного гена куриного интерферона-гамма (ИФН-γ) была клонирована в составе вектора, обеспечивающего продукцию и секрецию рекомбинантного белка клетками дрожжей P. pastoris (Патент РФ, 2010). Однако полученный интерферон был подвержен протеолитической деградации, возможно, обусловленной наличием нескольких потенциальных сайтов узнавания трипсиноподобными протеазами, два из которых расположены на С-конце молекулы (Татьков и др.,1995).
Исследования стабильности ИФН-γ и способов предотвращения их деградации касаются, в основном, белка человека. Существует ряд работ, в которых показано, что делеция 10 аминокислот с С-конца молекулы ИФН-γ не только не приводит к потере его активности, но и повышает его стабильность за счет удаления потенциального сайта протеолитической деградации (Waschutza et al., 2000; Мирошников и др., 2005). Известны работы по стабилизации димера ИФН-γ, необходимого для проявления биологической активности, за счет введения дополнительных цистеинов (Takehara et al, 2002; Savan et al, 2009).
Для изучения влияния различных модификаций С-конца куриного ИФН-γ на его стабильность получили 3 варианта белка (Рисунок 1).
130 140
1. ИФН-γ …ProSerPheLysArgLysArgSerGlnSerGlnArgArgCysAsnCys
2. ИФН-γ (Δ1) …ProSerPheLys
3. ИФН-γ (Δ2) …ProSerPheLysCys
4. ИФН-γ (Δ3) …ProSerPheLysGln
Рис.1. Аминокислотная последовательность С-конца молекул нативного и модифицированных куриных ИФН-γ:
1 – нативный белок; 2 – модифицированный белок, у которого отсутствует 12 С-концевых аминокислот; 3,
4 – модифицированные белки, у которых отсутствует 11 аминокислот, и С-концевой аминокислотой является цистеин или глутамин, соответственно. Потенциальные сайты расщепления трипсиноподобными протеазами подчеркнуты.
Для сравнения стабильности немодифицированного и модифицированных ИФН-γ изучали изменение содержания исследуемых белков при культивировании штаммов-продуцентов и в процессе хранения культуральной среды при 4оС. Результаты показали, что немодифицированный интерферон, в отличие от модифицированных вариантов, подвергается протеолитической деградации уже после 5 дней хранения, а на 10 день остается в среде в следовых количествах.
Для того чтобы выяснить, как влияет модификация молекулы ИФН-γ курицы на его биологическую активность, определяли противовирусную активность и изучали экспрессию генов, промоторы которых содержат IRSE (interferon response sequence element) последовательности (Sadler, Williams, 2008). Использование второго метода позволяет оценить, может ли рекомбинантный модифицированный интерферон участвовать в сигнальном каскаде, запускаемом в клетках птиц нативным интерфероном.
Противовирусную активность рекомбинантных модифицированных интерферонов тестировали по подавлению цитопатической активности вируса везикулярного стоматита на культуре клеток первичных фибробластов курицы (КЭФ), которые были любезно предоставлены сотрудниками Всероссийского научно- исследовательского ветеринарного института птицеводства РАСХН (г.Ломоносов). В качестве контроля использовали немодифицированный ИФН-γ курицы. Полученные результаты позволяют заключить, что проведенные изменения в структуре ИФН-γ не влияют на его противовирусную активность.
Для оценки способности модифицированных рекомбинантных интерферонов запускать сигнальный каскад и активировать транскрипцию генов, содержащих в промоторе ISRE-последовательности, использовали ОТ-ПЦР в реальном времени.
Одним из белков, индуцируемых в ответ на интерфероны, является дцРНК-зависимая протеинкиназа (PKR), которая фосфорилирует фактор инициации трансляции эукариот eIF2 и участвует в обеспечении противовирусного действия интерферона, служит посредником при активации транскрипции генов, экспрессия которых зависит от интерферона (Okumura et al, 2013).
Еще одним белком, активность которого индуцируется интерфероном, является 2'-5'- олигоаденилатсинтетаза, кодируемая геном OASL. Белок первоначально синтезируются в неактивной форме, а его активация происходит при взаимодействии с дцРНК. Белок Oasl осуществляет синтез олигоаденилатов с необычной 2'-5'-фосфодиэфирной связью, которые активируют латентную эндорибонуклеазу L, катализирующую деградацию как вирусной, так и клеточной РНК, что приводит к ингибированию белкового синтеза в зараженных вирусом клетках. Регуляторный район гена OASL содержит сайт ISRE, необходимый для активации генов в присутствии альфа-интерферона. Клетки, нечувствительные к альфа-интерферону, способны синтезировать белок Oasl в ответ на гамма-интерферон (Hovanessian et al, 1987).
В работе использовали также ген MX1, который кодирует интерферон-индуцируемую ГТФ-азу. При заражении клетки белок Мх1 связывается с одной из субъединиц вирусной полимеразы, блокируя репликацию вируса. Оценка уровня экспрессии гена MX1 человека используется в клинических исследованиях в качестве маркера дифференциации вирусных и бактериальных инфекций, а также надежного маркера для оценки биодоступности интерферонов I типа (Verhelst et al., 2013).
Исходя из данных о том, что экспрессия генов протеинкиназы (PKR), 2'-5'-олигоаденилатсинтетазы (OASL) и гена MX1 в значительной степени индуцируется интерферонами I и II типов, биологическую активность куриных интерферонов определяли по изменению уровня экспрессии данных генов относительно контрольного гена глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы (GAPDH) в клетках КЭФ (Рисунок 2).
Результаты, представленные на Рисунке 2, показали, что в присутствии рекомбинантных модифицированных и немодифицированного ИФН-γ курицы уровень экспрессии гена PKR относительно контрольного гена GAPDH возрастает примерно в 2 раза по сравнению с контрольным образцом, содержащим белки культуральной среды исходного штамма, а для генов OASL и MX1 эти различия еще больше.
Экспрессия гена PKR в клетках, которые культивировали в присутствии белков культуральной среды исходного штамма дрожжей, может объясняться тем, что представленные на поверхности куриных фибробластов TLR-рецепторы способны воспринимать дрожжевые белки как антигенные детерминанты и, связывая их, запускать экспрессию PKR.
Таким образом, удаление потенциальных сайтов расщепления трипсиноподобными протеазами повышает стабильность куриного ИФН-γ, синтезируемого дрожжами P. pastoris, и не влияет на его биологическую активность.
Список литературы
1. Мирошников П.Н., Лебедев
Л.Р., Терещенко Т.А. // Биотехнология. 2005.
№1. C.11-18. 2.
Патент РФ. 2010. №2386694.
3.
Татьков С.И., Смирнова
О.Ю., Цивковский Р.Ю. и др. // Молекуляр. биол. 1995. NT 29. №.5. C.1095-1101.
4.
Boehm T., Pirie-Shepherd S., Trinh L.B. et al. // Yeast. 1999. V.15. P.563-572.
5.
Cereghino G.P., Cereghino J.L., Ilgen C., Cregg J.M. // Curr. Opin Biotechnol. 2002.
V.13. Р.329-332.
6.
Hovanessian AG, Laurent AG, Chebath J. et. al. // EMBO J. 1987. 6(5). P.1273-80.
7.
Okumura FI, Okumura AJ, Uematsu
K et.al. // J Biol Chem. 2013. 288(4). P. 2839-2847.
8.
Sadler AJ, Williams
BR. //Nat Rev Immunol. 2008. 8(7). P. 559-68.
9.
Savan R., Ravichandran S., Collins J.R. et al. // Cytokine
& Growth Factor
Reviews. 2009. V. 20. P. 115-124.
10. Shapiro R.I., Wen D., Levesque M. et al. // Protein
Expres. Purif.
2003. V.29. P.272-283.
11. Takehara K., Kamikawa
M., Ohnuki N. et. al. // J.Vet.Med.Sci. 2002. №64. V.2. P. 95-100.
12. Verhelst J, Hulpiau
P, Saelens X. // Microbiol Mol Biol Rev. 2013.
77(4). P.551-66.
13. Waschutza G., Li V., Otto B. // United State Patent № 6.046.034. 2000.
14. Werten M.W., van den Bosch T.J., Wind R.D. et al. // Yeast. 1999. V.15. P.1087-1096.
