11 декабря 2015г.
Ключевые слова
Инфекционные антигены - P.aeruginosa, Е.соli, НСТ-тест, нитросиний тетразолий, возрастные категории, экспериментальные модели.
Вступление
Известно, что фагоцитирующие клетки (ФК) являются барьерным фактором первичного иммунитета, от функционального состояния которых зависит вектор развития последовательных иммунных реакций в ответ на присутствие
инфекционного антигена [1,6]. Фагицитирующие клетки обеспечивают инактивацию различных антигенов и лигандов с помощью активированных форм кислорода и ферментов [3]. Причем генерализованные и локальные изменения иммунофизиологических реакций приводят к постепенному формированию патологических процессов в макроорганизме [8].
Научные интерес представляет пока недостаточно исследованная реакция первичных врождённых факторов иммунитета (фагоцитоза) у экспериментальных животных различного возраста, так как в процессе онтогенеза взрослые особи претерпевают постоянные контакты с антигенами различной природы, в том числе и инфекционными [5,9].
Физиологическая функция ФК, как и все процессы живых организмов, носят изменчивый характер. Так, например, под воздействием антигенов и токсинов ФК могут частично или полностью утрачивать фагоцитирующую способность. Эффективность функционирования иммунной системы снижается с увеличением возраста, в результате чего возрастает заболеваемость и смертность от инфекционных болезней. При старении эффективность работы иммунной системы снижается, но различные звенья иммунореактивности страдают в разной степени [2]. На этом фоне формируются определённые патерны иммунных реакций первичного и вторичного адаптивного иммунитета.
Из данных мировой и отечественной научной литературы известно, что при старении нарушается функция ферментов, обеспечивающих различные биологические процессы в следствии эпигиномных изменений этих биологических катализаторов, многие ферменты претерпевают конформационные изменения, а значит и функциональные способности [11].
Таким образом, актуальным является изучение ферментативной активности фагоцитирующих клеток на разных этапах онтогенеза.
Цель
Исследование механизмов, обеспечивающих активность фагоцитирующих клеток и завершённость процесса фагоцитоза у экспериментальных животных разного возраста на модели воспалительного процесса, индуцированного различными видами антигенов.
Материалы и методы
Материалом для эксперимента служили белые крысы-самцы 3-х месячного возраста («молодые») массой 100 - 140гр. (n=70) и 22-х месячные («старые») с массой тела 200 -240 гр.(n=70). Первая (3-х месячные самцы, животным этой группы внутрибрюшинно вводили 1,5 мл стерильного физиологического раствора) и вторая (22-х месячные животные, которым внутрибрюшинно вводили 1,5 мл стерильного физиологического раствора) группы крыс служили контролем. Второй и третьей группе животных вводили внутрибрюшинно суточную агаровую культуру Pseudomonas aeruginosa № 27835 АТСС (вводили 1,5 мл взвеси бактерий, которая содержала 109 КОЕ/мл). Четвёртой и пятой группе животных вводили внутрибрюшинно суточную агаровую культуру Escherichia соli № 25592 (F-50) АТСС (вводили 1,5 мл взвеси бактерий, которая содержала 109 КОЕ/мл).
Инфицированных животных выводили из эксперимента путём декапитации на 3, 5, 7 сут., после чего забирали кровь. В крови всех крыс определяли общую окислительно-восстановительную активность гранулоцитарных нейтрофилов в тесте восстановления нитросинего тетразолия (НСТ-тест) по стандартной методике [4].
В НСТ-тесте оценивали спонтанные (СП) и стимулированные (СТ) реакции с помощью зимозана, который является стимулятором фагоцитарной активности нейтрофилов [4,7]. В двухвариантном НСТ-тесте определяли состояние функционального резерва клеток, который представляет собой разницу между числом (интенсивностью) стимулированных диформазанпозитивных клеток и количеством (интенсивностью) спонтанно окисляющих диформазанпозитивных клеток. При постановке этого теста определяли показатель среднего цитохимического коэффициента в спонтанном тесте (СЦК СП) и показатель среднего цитохимического коэффициента в стимулированном тесте (СЦК СТ), который отображает интенсивность энергетических процессов ферментных систем фагоцитирующих клеток. Показатель индекса стимуляции (ИС) рассчитывали из показателей среднего цитохимического коэффициента спонтанного и стимулированного.
Экспериментальные данные обрабатывали общепринятыми методами вариационной статистики. Статистическую обработку цифровых данных проводили с помощью программы BIOSTAT. Выводы статистических гипотез проводили на уровне значимости Р≤ 0,05.
Результаты и их обсуждения
У здоровых животных разного возраста выявили значимые отличия в показателях НСТ-теста (Таб.1). У молодых интактных животных ферментативная активность более активна в стимулированном тесте, на низкий метаболический резерв фагоцитов в старшей возрастной контрольной группе указывает низкий показатель стимулированного теста 54±2,50
% против 77±2,90 % у молодых. В спонтанном тесте достоверных отличий между возрастными группами не было.
В ходе эксперимента выявили, что интенсивность ферментативной активности у молодых животных в 1,5 раза превышало показатели индекса стимуляции (ИС) такового у старых животных и составил 2,7±0,09 у молодых и 1,8±0,06 у старых животных (Таб.1).
При введении антигена P.aeruginosa на з сутки эксперимента у молодых животных увеличился показатель спонтанного теста в 2,5 раза и составил 71±3,50 %, а стимулированного теста в 1,2 раза (82±2,10 %). Но на 5 сутки эксперимента у молодых животных показатели спонтанного и стимулированного теста снижаются по сравнению с контролем. К 7 суткам эксперимента у 3-х месячных животных выявили достоверное снижение стимулированного теста, который составил 46±3,60 % при 77±2,90 % в контроле (Таб.2).
Примечание:* - достоверность различия с контролем Р≤ 0,05
У молодых показатель индекса стимуляции (ИС) снижается на всех этапах эксперимента, что свидетельствует о неудовлетворительном состоянии бактерицидной системы клеток.
У старых животных после введения антигена P.aeruginosa индекс стимуляции (ИС) в НСТ-тесте во все сроки эксперимента был немного увеличен, особенно на раннем этапе эксперимента (3 сутки) и составил 2,13±0,09 при 1,80±0,06 в контроле, что свидетельствует о наличии функционального резерва иммунокомпетентных клеток.
Примечание:* - достоверность различия с контролем Р≤ 0,05
Во всех обследуемых группах (III, IV, V и VI) после введения антигенов P.aeruginosa и Е.соli у молодых и старых животных во все сроки эксперимента были однонаправленно увеличены показатели СЦК СП и СЦК СТ по сравнению с этими показателями контрольних групп (I и II).
Индекс стимуляции (ИС) у молодых животных с моделью воспаления антигеном Е.соli на всех этапах эксперимента снизился в сравнении с контролем, что свидетельствует о низком метаболическом резерве фагоцитов у молодых животных. У старых же с моделью воспаления антигеном Е.соli лишь на 3 сутки после введения микроорганизма наблюдалось увеличение показателя индекса стимуляции (ИС) 2,04±0,09 % при 1,8±0,06 % в контроле. К 5 суткам эксперимента у 22-х месячных старых животных наблюдали выраженное снижение индекса стимуляции (ИС), который составил 1,29±0,04 при 1,8±0,06 % в контроле, что свидетельствует о возрастных отличиях показателей, зависящих от разницы природы антигена и стадии воспалительного процесса.
Таким образом, у старых животных с моделью воспаления, индуцированного после однократного введения бактериальных антигенов различных видов - P.aeruginosa и Е.соli выявлено незначительное однонаправленное повышение ферментативной активности гранулоцитарных нейтрофилов на первых этапах эксперимента.
Выводы
1. Индукция барьерных врождённых факторов иммунитета зависит от функционального состояния внутриклеточных ферментов фагоцитирующих клеток. У молодых интактных животных выявлен в 1,4 раза более высокий показатель индекса стимуляции (ИС) по сравнению с этим показателем у старых интактных животных.
2. У молодых животных, инфицированных антигенами P.aeruginosa, Е.соli показатель индекса стимуляции ФК был более снижен (Р< 0,05) в сравнении с данным показателем у старых животных на 3, 5 и 7 сутки эксперимента. Это свидетельствует об истощении функциональной активности ферментов гранулоцитарных нейтрофилов у молодых животных.
3. У старых животных после введения антигена P.aeruginosa индекс стимуляции ФК в НСТ-тесте во все сроки эксперимента был незначительно увеличен, особенно на 3 сутки наблюдения, что свидетельствует о наличии функционального резерва этих иммунокомпетентных клеток.
4. При индукции воспаления у старых животных с помощью антигена Е.соli показатель ИС был достоверно снижен к 5 суткам, что свидетельствует об истощении функционального резерва ФК.
5. На разных этапах индукции воспалительного процесса у молодых и старых животных выявили изменения активности ферментов гранулоцитарных нейтрофилов, зависящие как от возраста экспериментальных животных, так и от антигенов бактерий разной видовой принадлежности.
Список литературы
1. Anand R.J., Dai S., Gribar S.C., et al.// J Immunol, 2008 – V.181-P.8534-8543.
2. Анисимов В.Н. Молекулярные и физиологические механизмы старения // СПб.: Наука. – 2003. – 468 с.
3. Bastian N. R. Assembly and regulation of NADPH oxidase and nitric oxide synthase / N. R. Bastian, J. B. Hibbs // Curr. Opion. Immunol. – 1994. – V. 6. – P. 131 – 139.
4. Виксман М.Е. Способ оценки функциональной активности нейтрофилов человека по реакции восстановления нитросинеого тетразолия: Метод. Рекомендации / М.Е. Виксман, А.Н Маянский – Казань: Казанский НИИЭМ, 1979.
– 11 с.
5. Возможная роль «метаболической памяти» в формировании ответной реакции на стресс – факторы у молодых и взрослых организмов / А.И. Божков, В.Л. Длубовская, Ю.В. Дмитриев и др. // Успехи геронтологии. – 2009. – Т.22,
№2. – С.259 – 268.
6. Дранник Г.Н. Клиническая иммунология и алергология. – К., 2010. – 552с.
7. Dale D.C. The phagocytes : neutrophils and monocytes / D.C. Dale, L. Boxer, W.C. Liles // Blood. – 2008. – V. 112, (4). – P. 935 – 945.
8. Зильбер Л.А. Фагоцитарная теория И.И. Мечникова / Л.А. Зильбер. В кн.: Вопросы иммунитета. Избр. Труды. М.: изд-во АН СССр. – 1951.-673 с.
9. Кузьменко О.В. Фагоцитарная активность нейтрофилов периферической крови крыс с различной реакцией на стресс
/ О.В. Кузьменко, Н.А. Никифорова, М.О. Иваненко // Весник Харьковского национального университета им. В.Н. Каразина. Серия: биология. – 2010. – Вип. 11 – С. 173 – 177.
10. Спивак Н.Я., Богданова И.М., Мартеросова Н.И., Малайцев В.В. Физиологический журнал, - 2008 – Т.54 № 6 С.65- 78.
11. Хаитов Р.М. Физиологические и иммунологические системы / Р.М. Хаитов // Российский физиологический журнал им. И.М.Сеченова.- 2000. – Т.86, №3. – С. 252 – 267.
12. Zhou J., Tai G., Liu Y., et al // Cell Immunol, 2008, in press.
