ИЗМЕНЕНИЕ ИММУНОФИЗИОЛОГИЧЕСКИХ РЕЗЕРВОВ ПРИ РАЗЛИЧНЫХ КЛИНИЧЕСКИХ ФЕНОТИПАХ МИАСТЕНИИ

Введение
Миастения является мультифакториальным аутоиммунным заболеванием и может служить моделью для изучения и понимания тонких молекулярных и клеточных механизмов, лежащих в основе аутоиммунных процессов (Karni A., Zisman
E. , Katz - Levi Y. et al., 2009). Основным патогенетическим процессом при миастении является нарушение синаптической передачи вследствие образования аутоантител и структурно-функциональных изменений тимуса ( Jahn K. , Franke C., Bufler
J. , 2008). При миастении формируются дисбаланс процессов саморегуляции и адаптации вследствие нарушения кооперации факторов иммунонейроэндокринного комплекса, что сопровождается нарушением гомеостаза организма. У больных миастенией имеет место выраженный клинический полиморфизм (Ito Y., Miledi R. , Vincent A. , Newsom - Davis J., 2007) . Различные клинические фенотипы миастении формируются после действия стрессорных и инфекционных триггерных факторов с последующим развитием различных иммунопатологических процессов, включая аутолиз тканей гуморальными компонентами и их разрушение со стороны агрессивных клонов Т - лимфоцитов (Infante AJ , Levcovitz H. , 2010).
Изучены многие механизмы формирования нейтротранмиттерных нарушений при миастении и известна генетическая предрасположенность к данному заболеванию (Inoue M. , Okumura M. , Miyoshi S. et al. , 2009). Этиология данного заболевания окончательно не установлена, нет единого патогенетической концепции, единых подходов к тактике лечения заболевания.
Цель
Изучение особенностей функциональной активности иммунокомпетентных клеток для выяснения механизмов формирования иммунопатологических реакций у пациентов с различной гетерогенностью клинических фенотипов миастенией для направленной многокомпонентной иммунокорекции.
Материалы и методы
Обследовано 152 пациента (125 женщина и 27 мужчин возрастом от 13 до 69 лет) с различными клиническими фенотипами миастении и поражением тимуса, которые были разделены на три группы. Первую группу (М) составили 24 пациентов с миастенией без поражения тимуса, вторую группу (МГ) составили 110 пациентов с миастенией и гиперплазией тимуса; третью группу (МТ) – 18 пациентов с миастенией, сочетающейся с различными типами тимом. Для оценки тяжести миастении использовали классификацию (Viets, Schwab, 1975).
Экспрессию кластеров дифференцировки CD8+, CD11а+, CD11b+, СD16+, CD19+, CD31+, CD41+, CD45+, CD50+, CD54+ на субпопуляциях иммунокомпетентных клеток и частоту встречаемости иммунных клеток с высокой плотностью лейкоцитарных рецепторов HLA-DR+ оценивали методом непрямой иммунофлюоресценции с использованием моноклональных антител, меченых FITC – красителем. Окрашенные клетки анализировали методом люминесцентной микроскопии.
Результаты исследований
Для выяснения механизмов формирования иммунопатологических процессов у пациентов с миастенией важным является оценка функционального резерва иммунокомпетентных клеток, осуществляющих инициацию и реализацию вторичного адаптивного иммунитета. Экспрессия лейкоцитарных антигенов HLA DR + ІІ класса, которые представляют собой рецепторные маркерные белки, распознающие чужеродные антигены, осуществляют иммуногенетический контроль, посредством изменения плотности экспрессии рецепторов на клеточной поверхности.
В исследовании выявлено, что плотность экспрессии рецепторов лейкоцитарных антигенов HLA DR + ІІ класса на иммунокомпетентных клетках у больных с различными клиническими фенотипами достоверно отличались от средних референтных величин (15,02,1)% (Рис.1 и Рис.2). У пациентов в группах с М и МТ высокая плотность рецепторов HLA DR+ ІІ класса встречалась в два раза чаще (32,08,7)% и (37,24,6)%, чем в контрольной группе. Напротив, в группе МГ этот показатель был ниже контроля в 4 раза - (3,51,5)%.



Как известно, кооперация врожденного и вторичного адаптивного иммунитета осуществляется при непосредственном участии молекул главного комплекса гистосовместимости HLA на антигенпрезентирующих клетках, Т- хелперах 1 типа (CD4+) и цитотоксических Т-киллерах (CD8+). Агрессивные клоны CD4+ Т-хелперов у больных с генерализованной миастенией обладают способностью распознавать и связывать субъединицы ацетилхолиновых рецепторов, связанных с молекулами HLA антигенпрезентирующих клеток, что может изменять функциональную активность Т-лимфоцитов.
У больных всех исследуемых групп выявили снижение экспрессии рецепторов CD8+Т-клеток (рис. 3). У пациентов с М и МГ экспрессия рецепторов цитотоксических CD8+ Т-лимфоцитов-киллеров была максимально угнетена и составила (7,1 ± 2,3)% и (7,2 ± 2,4) % соответственно, что в 4 раза ниже контрольных значений (28,0 2,6)%. У пациентов с МТ экспрессия кластеров дифференцировки CD8+ Т-лимфоцитов была также ниже контроля и в среднем составила (14,2 ± 7,2) %. Однако, снижение этого показателя было более выраженным, чем у больных с М и МГ.




Поэтапная активация Т- и В-лимфоцитов – клеток адаптивного иммунитета сопровождается усилением синтеза ДНК, что является пусковым моментом образования специфических клонов лимфоцитов против определенных антигенов. У больных с М, МГ, МТ выявили дисбаланс экспрессии и других экстрацеллюлярных кластеров дифференцировки - CD11a и CD11b на иммунных клетках, которые отличались степенью угнетения экспрессии в разных группах больных миастенией (Рис. 3). Поскольку экспрессия мембранных белков-интегринов CD11a и CD11b обеспечивает взаимодействие между

лейкоцитами и эндотелиальными клетками, феномен их снижения следует рассматривать как нарушения продукции эндотелиальных факторов микроокружения.
В группе М экспрессия рецептора CD11a+ была снижена на 18% и соответствовала значению (71,3 ± 13,9)% при контроле (97,02,1)%, в группе МГ – (84,3±9,1)%, что на 10% ниже референтных величин, а в группе МТ отмечали наибольше угнетение – (68,2 ± 15,0)%, что на 30% снижено относительно контроля (Рис. 5 и Рис. 6).



Экспрессия CD11b+, напротив, была повышена во всех группах и составила (56,1 ± 10,4)% в группе М, (89,3+7,3)% в группе МГ и (62,7 ± 6,9)% в группе МТ при контроле (19,66,2)% (рис. 3), что может влиять на индукцию агрегационных эффектов в сосудистом эндотелии.
Содержание субпопуляции лимфоцитов CD16+ - NK-клеток, обладающих цитотоксичностью, было достоверно повышено в группе пациентов с МГ (19,0 ± 6,1)% и МТ (19,0±9,1)% при контроле (8,0 4,3)%. У пациентов группы М данный показатель не отличался от контрольных значений и составил (13,6 ± 2,1)% (Рис.7.)
Экспрессия рецепторов CD31+, CD41+ и CD45+, которые инициируют агрегацию совместно с эндотелиальными факторами, у больных групп М, МГ и МТ также отличались по степени интенсивности.
Достоверное трехкратное увеличение субпопуляции иммунокомпетентных клеток CD31+, участвующих в трансэндотелиальной миграции лейкоцитов, ангиогенезе и активации интегринов до значения (35,0± 11,3)% отмечено в группе пациентов МТ, а в группе МГ – двукратное увеличение показателя до (22,1±3,1)%. Рисунок 6 иллюстрирует избыточное связывание специфических моноклональных антител с рецепторами CD31+ иммунокомпетентных клеток у больных с МТ. В группе М экспрессия этого рецептора была несколько повышена (15,1 6,7)% относительно контроля (12,2 3,3)%, но недостоверно.
Состояние агрегационных свойств тромбоцитов у обследованных больных оценивали также по интенсивности экспрессии интегрина CD41+. Экспрессия CD41+ рецепторов достоверно не отличалась от референтных значений, и в группе М составила (79,1±9,6)%, в группе МГ – (78,5±8,4)%, в группе МТ – (75,5 ± 21,4) при контроле (95,0 13,9)%. Достоверных отличий от контроля в селективных группах больных миастенией не выявлено (Рис. 5 и Рис. 8).
Помимо рецепторов, вызывающих изменение агрегационных свойств иммунокомпетентных клеток, изучали экспрессию ко-стимулирующих молекул на активированных иммунных клетках. Только в группе М выявили сниженную экспрессию CD45 – рецептора, регулирующего передачу сигнала от T- на B-клеточные рецепторы и рецепторы провоспалительных цитокинов. Средние значения показателя в группе М составили (81,0±10,3)% при контроле (98,7  12,8)%. В группах МГ и МТ этот показатель достоверно не отличался от контроля и составил (85,6±7,6)% и (94,0 ± 19,8)% соответственно.
При исследовании экспрессии экстрацеллюлярного рецептора CD19+ на В-лимфоцитах - продуцентах иммуноглобулинов, в группе пациентов с МТ выявили его достоверное увеличение до (31,1± 15,1)% при референтном интервале (15,04,8)%, что свидетельствует об активации функциональной активности В-лимфоцитов. В группе МГ и МТ это повышение было незначительным – (20,2 ± 8,1)% и (18,0 ± 1,0)% соответственно (Рис. 7).




Адгезивные свойства иммунокомпетентных клеток во многом зависят от домен-лигандного взаимодействия молекул адгезии и их рецепторов. Исследовали субпопуляции лимфоцитов, экспрессирующих CD50+ (ICAM-3) – лиганда адгезии лейкоцитов, участвующего в инициации иммунного ответа (рис.7). Выявили пятикратное повышение молекул адгезии CD50+ до значения (30,74,9)% в группе М и (31,64,8)% в группе МГ, а у МТ этот показатель увеличился более чем в 8 раз (52,63,1)% при контроле (6,41,8)%.
Рецептор молекулы CD54+ (ICAM-1) – интегрин, участвующий в агрегации наряду с эндотелиальными факторами, отличался по степени экспрессивности в различных группах. Содержание субпопуляции CD54+ у пациентов с М было достоверно выше, чем в группе сравнения, и в среднем составило (20,3 ± 2,6)% при контроле (10,2 ± 1,1)% . В группах МГ и МТ также отмечена повышенная экспрессия этого интегрина в среднем на 60%.
Таким образом, разнообразие клинических фенотипов миастении формируются за счет повышения экспрессии HLA- антигенов гистосовместимости и изменением экспрессии кластеров дифференцировки СD Т-лимфоцитов – хелперов, киллеров, NK-клеток – CD16+ и CD19+ В-лимфоцитов, изменениями экспрессии адгезивных молекул CD31+, CD50+ и CD54+. Патогенетическими факторам различных клинических фенотипов миастении является изменение экспрессии лейкоцитарных антигенов гистосовместимости HLA, дисбаланса кластеров дифференцировки CD иммунных клеток и формирование агрессивных клонов Т-лимфоцитов.
Знание индивидуальных типов иммунопатологических реакций у больных с различными клиническими фенотипами миастении позволит осуществлять направленную индивидуальную многокомпонентную и многоэтапную иммунокоррекцию с учетом состояния рецепторов иммунокомпетентных клеток и сопряженной передачей активирующего сигнала на специфические регуляторные белки.