ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ИММОБИЛИЗИРОВАННЫХ БИОПОЛИМЕРОВ ДЛЯ ИЗУЧЕНИЯ ВЛИЯНИЯ АНТИТЕЛ НА АКТИВНОСТЬ ЭНЗИМОВ ПУРИНОВОГО МЕТАБОЛИЗМА

Болезни костно-мышечной системы, в том числе и ревматические заболевания (РЗ), находятся на одном из первых мест среди причин ухудшения качества жизни, а также временной и стойкой нетрудоспособности. Для своевременной диагностики начальных проявлений активации и прогрессирования патологического процесса при РЗ целесообразно расширение круга используемых клинико-лабораторных, и в первую очередь иммунологических показателей [2, 3; 4, 295]. Также обсуждается вопрос об участии в патогенезе аутоиммунных заболеваний различных нарушений, связанных с метаболическими процессами, происходящими на клеточном или субклеточном уровнях, медиаторами которых являются ферменты. Возросший интерес к изучению метаболизма пуриновых соединений в норме и при патологии связан не только со значением данного цикла в обмене нуклеиновых кислот, но и с той важной биологической ролью, которую выполняют его отдельные, составные части: ферменты и промежуточные субстраты.
Для определения широкого спектра аутоантител при РЗ используются самые различные подходы, но в настоящее время наиболее широко применяются иммуноферментный (ИФА) и иммунофлюоресцентный (ИФЛ) методы анализа [4, 293]. Расширение спектра изучаемых при РЗ аутоантител к энзимам может быть достигнуто переводом растворимых биополимеров в нерастворимую форму с сохранением их биологических свойств и возможностью дальнейшего использования в качестве антигенной матрицы в иммунологических методах диагностики.
Цель: изучение влияния метода эмульсионной полимеризации на растворимые биополимеры для использования их в качестве антигенной матрицы при создании антигенных наносистем (АНС) для использования в методах иммунодиагностики.
Материалы и методы.
В качестве антигенов использовались коммерческие препараты основных ферментов пуринового метаболизма (ПМ) производства фирмы «Sigma» (США): препарат аденозиндезаминазы из печени быка (АДА, Adenosine Deaminase from bovine spleen, Cat. № А 5043); препарат 5'-нуклеотидазы из яда гремучей змеи (5-НТ, 5'- Nucleotidase from Crotalus atrox venom; Cat. № N 5880); препарат пуриннуклеозидфосфорилазы из крови человека (ПНФ, Nucleoside Phosphorylase from human blood; Cat. № N 3514); препарат гуаниндезаминазы из печени кролика (ГДА, Guanase from rabbit liver; Cat. № G 5752). Для получения иммобилизированных форм изучаемых ферментов использовали растворы с соответствующей концентрацией: для АДА – 100 мкг/мл, для 5'-НТ – 100 мкг/мл; для ПНФ – 50 мкг/мл; для ГДА – 20 мкг/мл.
Результаты исследования.
Учитывая достаточную относительную молекулярную массу используемых в исследовании ферментов (АДА – 36 кДа, 5'-НТ – 60-120 кДа; ПНФ – 90-92 кДа; ГДА – 100-120 кДА), иммобилизацию проводили методом

эмульсионной полимеризации в модификации И.П.Гонтаря с соавт. [1, 2] в потоке газообразного азота с включением в структуру гранул магнитного материала. По завершению полимеризации гранулы магнитосорбентов в течение 15-20 мин отмывали ацетоном и физиологическим раствором с детергентом твин-20 (0,05%) от непрореагировавших мономеров, эмульгатора и гексана.
В итоге были получены АНС, представляющие собой двойные полиакриламидные гранулы правильной сферической формы с размером частиц от 10 до 100 мкм. Средний диаметр гранул составил 55±6,8 мкм (при соотношении полимерный носитель: железо 2 : 1, в пересчете на сухую массу). Гранулы имели длительный срок хранения (до 2-х лет); после регенерации они были пригодны для повторного использования.
Процедура иммобилизации АДА, ГДА, 5'-НТ, ПНФ не вызывала изменения биологических свойств ферментов (см. Табл.1).

Активность иммобилизированной формы ферментов сохранялась более года, в то время как для растворимой формы энзимов было отмечено существенное снижение активности уже через 3 месяца. Кроме того, иммобилизация повышает устойчивость ферментов к воздействию высоких температур: после автоклавирования активность растворимых форм изучаемых ферментов снизилась практически до нуля, а иммобилизированных – незначительно (для АДА уменьшилась на 4,82%, для 5'-НТ уменьшилась на 5,39%, для ПНФ уменьшилась на 11,69%, для ГДА уменьшилась на 9,89%).
Для исследования количества аутоантител к ферментам ПМ в сыворотке крови больных РЗ использовали традиционный вариант ИФА, а также разработанный нами вариант ИФА с применением АНС. Различия в полученных результатах (при использовании классического варианта ИФА и иммуноферментной методики с применением АНС) могут быть объяснены с точки зрения свойств адсорбции белка на полистироле (анализ на полистироловых планшетах) и включения белка в структуру геля (анализ с помощью АНС) и кинетики реакции образования комплекса антиген-антитело на разделе фаз.
Примерная сорбционная емкость, рассчитанная с использованием модели Esser P. (1997 г.), в которой идеализированные молекулы антигена, имеющего сферическую форму, расположены на поверхности планшета в виде плотного монослоя, для антигена (в качестве примера была выбрана ГДА) составляет около 400 нг/см2. Площадь лунки (для планшета Nunc MaxiSorp), соприкасающаяся с раствором, при заполнении ее 200 мкл раствора антигена составляет 1,54 см2, следовательно, максимальная теоретическая сорбционная емкость лунки составит около 600 нг. В то же время, при использовании АНС, площадь поверхности, соприкасающейся с исследуемой сывороткой существенно больше (для гранул АНС, размером от 10 до 100 мкм площадь их поверхности при использовании 100 мкл 50% взвеси гранул составит в среднем 16,5 см2, то есть более чем в 10 раз превышает площадь поверхности лунки при традиционном варианте ИФА.
При расчете концентрации фермента на поверхности гранул примем, что слой антигена покрывает ¼ поверхности гранулы АНС и, следовательно, в одной пробе будет доступны для реакции 1,65 мкг антигена, что в 2,68 раза больше, чем при постановке анализа с антигеном, сорбированным на планшетах.
При постановке иммуноферментного анализа с использованием АНС наблюдаются как повышение аффинности, связанное с разделением фаз и повышением локальной эффективной концентрации связывающих участков антигена на разделе фаз, так и существенное увеличение концентрации антигена при уменьшении объема реагентов.
Таким образом, учитывая, что модифицированная методика иммуноферментного анализа с использованием АНС имеет очевидные преимущества перед методиками, использующими в качестве твердой фазы полистироловый планшет [3, 48], при проведении исследований, направленных на изучение процессов антителогенеза к ферментам ПМ, предпочтение было отдано ИФА с АНС.

В группу исследования были включены 178 больных с достоверным диагнозом РА. Количество больных РА с повышенным уровнем Ат к АДА (при проведении ИФА с использованием АНС) составило 55% (98 человек), к 5'-НТ
– 54% (96 человек), к ПНФ – 59,5% (106 человека), к ГДА – 45% (80 человек). Применение иммобилизированных ферментов в разработанном варианте ИФА позволило повысить чувствительность этого метода в 3-4 раза, по сравнению с традиционным вариантом, за счет увеличения концентрации антигенов в 20 - 100 раз, площади соприкосновения фиксированных антигенов с антителами, частоты встречаемости иммобилизированных антигенов с магнитными свойствами с соответствующими иммуноглобулинами при применении магнитной мешалки.
Заключение.
Изучение с помощью новых иммунологических методов (с использованием иммобилизированных ферментов) процессов образования и функционирования аутоантител к основным ферментам ПМ у больных РЗ, а также исследование "срыва" толерантности к наиболее защищенным от воздействия иммунной системы белковых структур – энзимам, способно помочь в определении влияния аутоантител к ферментам ПМ на функционирование соответствующих энзимов и обозначить роль данных антител в развитии повреждения при РЗ.

Список литературы

1. Гонтарь И.П., Зборовский А.Б., Левкин С.В., Сычева Г.Ф. Способ получения магнитных полиакриламидных гранул // Авторское свидетельство № 1582657. – 1990.
2. Насонов Е.Л., Александрова Е.Н. Современные стандарты лабораторной диагностики ревматических заболеваний. М., 2006; с. 3.
3. Сущук Е.А. Клинико-диагностическое значение определения антител к церулоплазмину у больных системной красной волчанкой с использованием гранулированных антигенных препаратов с магнитными свойствами. - Дисс. … канд. мед. наук. – Волгоград, 2002. – 237 с.
4. Wiik A.S., Gordon T.P., Kavanaugh A.F., Lahita R.G., Reeves W., vanVenrooij W.J., Wilson M.R., Fritzler M., and the IUIS/WHO/AF/CDC Committee for the Standardization of Autoantibodies in Rheumatic and Related diseases. Cutting edge diagnostics in rheumatology: the role of patients, clinicians, and laboratory scientists in optimizing the use of autoimmune serology // Arthritis Rheum. (Arthritis Care & Research) 2004; 51: 291-8.