29 ноября 2015г.
Молекулярные структуры клеток стали доступны ученым для изучения благодаря последним достижениям науки. Одними из этих достижений стали приборы масс-спектрометры, которые все чаще встречаются в современных инновационных лабораториях. Масс-спектрометры являются наиболее точными, высоковоспроизводимыми и высокоэффективными приборами научной деятельности. Традиционному изучению белков на масс-спектрометре предшествует разделение белков 2D электрофорезом с последующей тандемной масс-спектрометрией (MS-TOF-TOF). Это позволяет достичь детального изучения белка, его структуры, конформации, выявления активных центров.
Однако метод тандемной масс-спектрометрии требует колоссальных затрат, наличие высококвалифицированного персонала, данный вид исследования достаточно трудоемкий, поэтому в России встречается только в крупных НИИ. Шире в отечественных лабораториях представлены масс-спектрометры линейного типа, позволяющие снимать протеомный спектр клеток в диапазоне от 2000 до 18000 Да, которые заводом-производителем настроены на идентификацию микроорганизмов. Масс-спектрометрирование направлено на решение основной задачи - белковое профилирование. Белковое профилирование - это метод прямого масс-спектрометрического анализа белковой фракции биологического объекта, позволяющий получать уникальные для каждого изучаемого объекта масс-спектры. Большое количество результирующих пиков на масс- спектре является репрезентативной фенотипической характеристикой, как отдельных белков, биологических жидкостей, тканей, так и микроорганизмов. По большей мере в данном диапазоне прибором считывается спектр рибосомальных белков. Выявление специфичных для конкретного вида микроорганизма спектров константных рибосомальных белков клетки за счет осуществления прямого белкового профилирования дает возможность констатировать и анализировать уникальные для изучаемого объекта, рода и вида, группы, боиомаркеры, являющиеся по существу «отпечатками пальцев», и расширяет возможности идентификации микроорганизмов.
Метод времяпролетной масс-спектрометрии MALDI TOF - это один из видов масс-спектрометрического анализа, используемый для характеристики микроорганизмов, рассматривается в качестве альтернативного подхода комплексу традиционных методов идентификации. MALDI TOF MS - основана на разделении ионов разных масс в вакууме под действием электрических и магнитных полей. Реализация этого принципа осуществляется за счет матрично-активированной лазерной десорбции изучаемого вещества в комплексе с времяпролетным анализатором (TOF), в котором частицы разной массы и одного заряда для всех ионов - 1+ (m/z) разделяется по времени пролета определенного расстояния до детектора, считывающей электрические сигналы, лежащие в основе построения спектров. Вся необходимая информация для идентификации микробов представляется на графике пиков, сопровождаемых значением m/z (отношения массы к заряду в ионизированном состоянии и уровней интенсивности). Так как заряд всех ионов одинаков (1+), то значение m/z равняется фактической массе частицы. Идентификация микроорганизмов методом линейной MALDI TOF MS проводится с помощью коммерческой базы данных MALDI Biotyper («Вruker»), содержащей референтные белковые профили 5000 видов микроорганизмов. До сегодняшнего дня в России отсутствовала база данных для биотипирования Vibrio cholerae. С появлением виртуальной коллекции протеомных профилей вибрионов появилась возможность детально изучать их характеристики без использования живых культур бактерий [2].
Отмечено, что внесение в коммерческую базу нескольких представителей V. cholerae позволяет проводить идентификацию возбудителей холеры. Вид V. cholerae обладает достаточно широким фенотипическим и генотипическим разнообразием, что диктует необходимость изучения закономерностей синтеза константных рибосомальных белков у представителей внутри вида на репрезентативной коллекции штаммов. Научные данные о возможностях внутривидовой дифференциации V. cholerae c помощью масс-спектрометрического анализа и существования расширенной библиотеки масс-спектров холерных вибрионов в литературе отсутствуют.
Создание расширенной библиотеки спектров коллекции холерных вибрионов, позволит проводить не только идентификацию V.cholerae, но и расширить возможности дифференциации внутри вида. Основным преимуществом программы MALDI Biotyper («Bruker Daltonics») является возможность пополнения персональной базы новыми спектрами и подключение к MALDI Biotyper - программе для обработки и анализа масс-спектров, которая в последующем будет основана на сравнении получении профилей с персональной библиотекой референтных спектров. В процессе идентификации сравниваются такие параметры, как положение пиков (m/z), частота, интенсивность.
В связи с этим, целью нашего исследования явилось создание персональной релевантной базы данных спектров V.cholerae разных биоваров, серологических групп и токсигенности, которая позволит идентифицировать, дифференцировать и сравнивать микробные изоляты на основе анализа фингерпринтов рибосомальных белковых клеток холерных вибрионов.
Материалы и методы.
Для создания системы референс - библиотеки масс-зарядов (m/z) были использованы 100 паспортизированных музейных штаммов охарактеризованных по комплексу показателей: принадлежности к серогруппе, биовару, объекту и году выделения, наличие генов холерного токсина (ctxAB+). Эти данные также были заложены в создаваемую базу данных масс-спектров. Персональная база должна быть создана на основе типичных штаммов, охватывающих более 90% внутривидового разнообразия. Выявлено, что точность идентификации значительно зависит от релевантности (смысловым соответствием между информационным запросом и полученным сообщением) базы данных и выбора референс - изолятов. Это является особенно важным для видов с широким генетическим и фенотипическим разнообразием, что характерно для вида V.cholerae. В качестве референтных штаммов для создания суперспектров были использованы штаммы: V.cholerae El Tor - ctxAB+ - 25, V.cholerae El Tor- ctxAB 24, V.cholerae classical - ctxAB+- 2, V.cholerae О139- ctxAB+- 5, V.cholerae O 139- ctxAB-- 4, а также V.cholerae не О1/не О139 ctxAB+- 20, V. cholerae не О1/не О139 ctxAB - -20. Подготовка материала для создания библиотек спектров проводилась с учетом требований биологической безопасности. Все образцы проводили через процедуру экстракции трифторуксусной кислотой (80% ТFА) для создания репрезентативных спектров, а также с целью обеззараживания культур холерных вибрионов. Экстракцию проводили в 50 мкл 80% TFA трифторуксусной кислоты, куда бактериологической петлей вносили 10 колоний образца для получения достаточного количества рибосомальных белков. Смесь оставляли на 30 мин., при комнатной температуре; добавляли 150 мкл бидистиллированной воды и 20 мкл ацетонитрила. Смесь встряхивали на вортексе, центрифугировали (12000-13000 об/мин) 2 минуты. Полученный супернатант проверяли на жизнеспособность при помощи высевов на специфическую стерильность. Определенно, что после проведенных этапов экстракции белков рост холерных вибрионов не наблюдался. Супернатант в количестве 0,5 мкл размещали на ячейке MSP-чипа, и после полного высыхания наслаивали 0,5 мкл раствора матрицы (а-циано - гидроксикоричная кислота в 50% ацетонитрила и 2,5% трифторуксусной кислоты). В программе Flexcontrol проводили обстрел в ручном режиме, снимали спектры и проводили анализ. Контроль составленной базы проводили на всех гомологичных штаммах, внесенных в базу и коллекции штаммов, которые в базу не были внесены. С созданной базой степень достоверных совпадений оценивали по показателям Score; в диапазоне от О до 3: значения - 2.300-3.00 (цвет зеленый) - указывает на высокую вероятность идентификации вида; значения - 2.000-2.299- надежная идентификация рода, и возможную идентификацию вида; значения - 1.700 - 1.999 - возможная идентификация рода, менее - 1.700 - невозможно идентифицировать.
Результаты и обсуждение.
Идентификация бактерий с использованием масс-спектрометрии MALDI TOF в линейном режиме представляет собой альтернативу традиционным лабораторным методам. Необходимым условием является построение высококачественных библиотек спектров для решения конкретной задачи. Применение программы Biotyper («Bruker Daltonics») позволяет проводить идентификацию 5000 видов микроорганизмов, включая мицелиальные грибы, дрожжи, Грам- отрицательные и Грам- положительные бактерии, в том числе белковые профили представителей рода Vibrio (V. agarivornas, V. algenalyticus, V.brasiliensis, V. campbelli, V. albensis и др.всего 47 видов).
Несмотря на то, что база данных "Bruker" не содержит профилей холерных вибрионов, определенный опыт идентификации при помощи коммерческой базы Biotyper был получен нами при мониторинге судовых балластных вод международного морского транспорта в бассейне Азовскою моря в 2012 году. Проведѐнное белковое профилирование культур (более 600 штаммов), выделенных при исследовании проб (350 проб), позволило идентифицировать представителен 13-ти видов рода Vibrio, при этом .4 штамм был позиционирован как V. albensis. В соответствии с современной таксономией (Bergeys. 2005 г.) биолюминесцнрующая бактерия V. albensis отнесена к V. cholerae биовар albensis. Проведѐнное бактериологическое исследование подозрительных культур в соответствии со схемой лабораторной диагностики холеры подтвердило принадлежность штаммов V. albensis к холерным вибрионам неаггютиннрующимся О1 холерной сывороткой V. .cholerae не О1/ не О139[1,3].
При масс - спектрометрическом анализе паспортизированные музейные штаммы V.cholerae El Tor с заведомо известной характеристикой были так же идентифицированы базой Biotyper как V. albensis, не позволяя получить информацию о наличии в исследуемой пробе возбудителя холеры. Однако, как выявлено, ориентировка на профиль V. albensis способствует идентификации холерных вибрионов на этапе отбора подозрительных на V.cholerae колоний.
Для создания персональной базы данных холерных вибрионов использовали охарактеризованные музейные штаммы. В программе Flexcontrol проводили обстрел в ручном режиме, снимали 40 спектров с каждой ячейки с образцом. С помощью программы MALDI Biotyper 3.0, открывали сохраненные спектры. Образцам (паттернам), полученным при белковом профилировании штаммов, присваивали номер и паспортные данные, характеризующие вид, биовар, серологическую группу, наличие генов токсинообразовання, объект и год выделения. В итоге, созданная нами персональная база данных холерных вибрионов, имеющая на сегодняшний день библиотеку профилей 100 штаммов, представляет собой репрезентативную коллекцию масс-спектров, позволяющих анализирован сходства и отличия представителей V. cholerae на основании таксон специфических белковых паттернов. характерных для биоваров, серологических групп и токсигенных вариантов. Суммарные спектры позволяют анализировать сходства и отличия типичных представителей V. cholerae. Основные спектры лежат в основе индексировании коэффициента совпадении Score при профилировании неизвестною микроорганизма, которые вычисляются на основе количества совпавших пиков, их интенсивности, степени совпадений масс-спектров (полное/неполное).
В отличие от базы данных Bruker в нашей базе содержится информация о коллекции спектров V. cholerae. При идентификации подозрительной на V.cholerae колонии (культуры) возможно использование двух баз данных коммерческой (при ориентации на род Vibrio) и персональной на вид V.cholerae и групп внутри вида.
Масс-спектр, состоящий из пиков разной интенсивности, является графическим отображением масс-пик листа (MSP Peak List), который представляет собой таблицу всех молекулярных масс полученных профилей каждого штамма. Данное отличие позволяет проводить частичную видовую дифференциацию и с высоким показанием Score идентифицировать V.cholerae О1. Анализ масс-пик листов белковых спектров V.cholerae позволил выявить существенные отличия между интенсивностью пиков V.cholerae El Tor и V.cholerae не О1/ не О139. Нами установлено, что большинство представителей О1 серогруппы имеют 5 пиков с индексом интенсивности (количество белков с конкретными молекулярными массами) (50-100%), в диапазоне молекулярных масс 4.000, 4.400, 5.000, 6.000, 7.000 Да), в то время как V.cholerae не О1/ не О139 - один, два пика с интенсивностью (70-100%) с м.м 4.000, 4.300 Да. MSP - лист позволяет объективно оценить и охарактеризовать в цифровых параметрах количественное содержание фракций рибосомальных белков штаммов разного происхождения и вирулентности. На основе спектров персональной базы получены дендрограммы, позволяющие проводить молекулярное типирование штаммов, выделенных в разные годы, и на разных территориях устанавливать степень филогенетического родства и происхождения свежевыделенных изолятов.
Контроль коллекции спектров на основе гомологичных и гетерологичных образцов показал, что каждый штамм коллекции V.cholerae El Tor был идентифицирован с высоким показателем Score (2-3), отражая вид, биовар, О1 серогруппу в 100% случаях, в то время как токсигенность определялась только в 60% совпадений, что делает необходимым подтверждение наличия гена холерного токсина с помощью классического подхода ПЦР- диагностики. В то время как контроль коллекции представителей вида V. cholerae О139 демонстрировал 100% принадлежность к серогруппе О139, 100% совпадений при определении токсигенных и атоксигенных вариантов с высоким показателем Score (2-3).
Проведѐнные исследования позволили создать персональную базу данных расширенной коллекции белковых спектров холерных вибрионов в дополнение к MALDI Biotyper («Bruker Daltonics»), позволяющую проводить видовую и частично внутривидовую дифференциацию V.cholerae (свидетельство о государственной регистрации базы данных «Белковые профили масс-спектров представителей вида V.cholerae для программы MALDI Biotyper №2013620585 от 29.04.2013 г.). В дальнейшем необходимо продолжение исследований, направленных на изучение диагностических возможностей масс-спектрометрического анализа для перспектив внутривидовой дифференциации, выявления и характеристики атипичных штаммов, а также для пополнения аналитической коллекции масс-спектров представителей вида Vibrio cholerae.
Список литературы
1. Водяницкая С.Ю., Телесманич Н.Р., Прометной В.И., Лях О.В., Чемисова О.С. "MALDI TOF - протеомный анализ в исследовании судовых, балластных вод в портах Ростовской области // Материалы V ежегодного Всероссийского конгресса по инфекционным болезням, 2013: 91.
2. Телесманич Н.Р., Агафонова В.В., Чайка И.А., Сеина С.О., Чемисова О.С., Гончаренко Е.В., Меньшикова Е.А., Полеева М.В. MALDI масс-спектрометрический анализ в типировании и внутривидовой дифференциации холерных вибрионов на основе создания референс – библиотеки протеомных профилей. // Медицинский Вестник Юга России №2 - 2014: 88-91.
3. Телесманич Н.Р., Чайка С.О., Водяницкая С.Ю., Чемисова О.С., Чайка И.А. Применение масс- спектрометрического метода MALDI-TOF для межвидовой дифференциации близкородственных видов. // Клиническая лабораторная диагностика. 2014 №8(59): 27-28, 37-38.
