29 ноября 2015г.
В настоящее время проблема лечения увеитов является одной из важнейших в офтальмологии во всем мире. Термином увеит объединены полиэтиологические воспалительные заболевания сосудистого тракта глаза с различной локализацией процесса и характером течения. Пациенты с увеитами и их осложнениями составляют от 5 до 18% больных глазных стационаров. При тяжелых формах заболевания слепота на оба глаза развивается в 10- 15%, а инвалидность по зрению составляет около 30% [5]. Полиэтиологичность увеитов и сложность их этиопатогенеза существенно затрудняют выбор правильной тактики лечения. Изучение биохимических процессов, происходящих в слезной жидкости и внутриглазных средах (влаге передней камеры и стекловидном теле), может дать новую информацию для более точного и детального понимания патогенеза увеитов.
Цель: изучить изменения биохимических показателей в слезе и во влаге передней камеры (ВПК) при экспериментальном увеите у кроликов.
Материалы и методы. Работа выполнена на 19 кроликах (38 глаз) породы шиншилла массой 2,0-2,5кг.
Использована адаптированная и усовершенствованная модель экспериментального увеита у кроликов [7, 9]. Кроликам дважды вводили нормальную лошадиную сыворотку: 5мл подкожно и на 10 день после подкожной инъекции - разрешающую дозу 0,07мл интравитреально. Для контроля действия внешних факторов на биохимические показатели был взят материал у 3 здоровых животных (6 глаз). Клиническую оценку течения воспалительного процесса в глазах проводили ежедневно путем биомикроскопии. На 3 и на 7 сутки у кроликов с помощью фильтровальной бумаги отбирали 0,25мл слезы, затем под местной анестезией путем парацентеза отбирали 0,15мл ВПК, в которой путем микроскопии подсчитывали количество лейкоцитов (среднее число в поле зрения из 5 полей), влагу центрифугировали и супернатант использовали для биохимических исследований. Концентрацию белка определяли по методу Лоури [11]. Антиокислительную активность в отношении гидроксильных радикалов (АОА-ОН-) определяли по параметрам кинетики хемилюминесценции в модельной системе гемоглобин-Н2О2-люминол [2]. Кинетику хемилюминесценции регистрировали на хемилюминометре Биотокс-7 (НПО Энергия). Активность супероксиддисмутазы (СОД) определяли по торможению автоокисления кверцетина [6]. Определение активности 2-макроглобулина (2-МГ) во влаге передней камеры проводили спектрофотометрически со специфическим субстратом n-бензоил-DL-аргинин-p-нитроанилид (БАПНА) [8]. Суммарное содержание продуктов обмена монооксида азота (NO) – нитратов и нитритов определяли фотометрически по интенсивности окраски проб при 540нм в реакции диазотирования нитритом сульфаниламида, входящего в состав реактива Грисса (Sigma-Aldrich, Германия) [10]. Величину оптической плотности образцов измеряли на микропланшетном фотометре Synergy MX (Bio-Tek, США). Статистическую обработку результатов проводили с использованием статистических пакетов программ Excel и Statistica.
Результаты и обсуждение: После введения разрешающей дозы лошадиной сыворотки в стекловидное тело у кроликов отмечались все характерные признаки переднего увеита. Внешние признаки воспаления (отек век, гиперемия конъюнктивы) были наиболее выраженными на 2 сутки после введения разрешающей дозы. К 7 суткам внешние признаки воспаления были уже менее выражены. Отек роговицы достиг наибольшей интенсивности к 3 суткам с его последующим снижением на 7 сутки. В единичных случаях отмечались хлопьеобразные преципитаты на эндотелии роговицы. Со стороны радужки наблюдался выраженный отек стромы, сглаженность рисунка, расширение, извитость и полнокровность кровеносных сосудов. Данные изменения продолжали нарастать на протяжении всего периода наблюдения. С первых же суток увеита отмечено образование пленок и хлопьев фибрина в передней камере. Наибольшее количество сгустков фибрина отмечалось на 3 сутки, к 7 суткам происходила их частичная резорбция. Начиная с 5 суток в единичных случаях обнаруживалась гифема. Формировались задние круговые синехии, зрачок не реагировал на свет и часто имел неправильную форму. На поверхности передней капсулы хрусталика обнаруживались крупные или мелкие преципитаты, сгустки фибрина, хрусталик становился диффузно мутным. Начиная с 4 суток в роговице был отмечен рост новообразованных сосудов со стороны лимба, длина которых к 7 суткам в среднем достигала 3мм. На поздних сроках наблюдения (6-7 сутки) пальпаторно определялось повышенное внутриглазное давление.
Биохимическое исследование слезы и водянистой влаги показало следующее. У кроликов с увеитом на 3 сутки концентрация общего белка в ВПК значительно превысила норму (в 42,5 раза). К 7 суткам концентрация белка в ВПК снизилась, однако по-прежнему оставалась выше нормы (в 8,7 раза). Повышение содержания белка в ВПК свидетельствует об увеличении проницаемости сосудов переднего отдела сосудистой оболочки глаза, т.е. о нарушении проницаемости гематоофтальмического барьера.
Ранее было показано, что у детей с увеитом изменяется антиокислительная активность как сыворотки крови, так и слезной жидкости соответственно фазе заболевания: снижается в период обострения, повышается в фазу ремиссии [4]. На 3 сутки экспериментального увеита нами также выявлено снижение АОА-ОН- в слезной жидкости до 50% от нормы. К 7 суткам отмечено незначительное повышение АОА-ОН-. Нами выявлены значительные изменения со стороны антиокислительной активности и в ВПК. В ней АОА-ОН- на 3 сутки была ниже нормы в 5,1 раз, на 7 сутки - в 6,3 раза. Данные изменения свидетельствуют о развитии окислительного стресса.
В ходе эксперимента мы также отметили, что на 3 сутки увеита активность СОД в слезе незначительно повышалась, однако на 7 сутки она снизилась и оказалась на 10% ниже нормы (p<0,02). В ВПК активность СОД изменялась более значительно: на 3 сутки заболевания активность СОД возрастала в 1,6 раз, что характерно для окислительного стресса [12]. Известно, что СОД может поступать в ВПК из плазмы крови, а также клеток воспалительного инфильтрата (лейкоцитов), содержание которых в ВПК при увеите сильно возрастает.
По нашим данным, лейкоциты в водянистой влаге в норме практически не обнаруживались (не более 1 в поле зрения), в острую фазу увеита (3 сутки) происходило значительное увеличение их количества (в 24,6 раза), к 7 суткам оно снижалось, и превышало норму в 7,2 раза. Выход лейкоцитов в ВПК свидетельствует о развитии воспаления во внутренних структурах глаза, а количество клеток отражает выраженность воспалительной реакции.
Нами установлено, что при увеите на 3 сутки уровень 2МГ в слезной жидкости увеличивался в 1,5 раза, а к 7 суткам снижался до 50% от нормы. В то же время в ВПК уровень 2МГ был выше нормы в среднем в 2,4 раза на 3 сутки, и на 1,9 раз 7 сутки. Любой воспалительный процесс сопровождается активацией протеолитических ферментов, основными функциями которых при воспалении являются борьба с инфекционными агентами, удаление поврежденных тканевых элементов, регуляция воспалительной реакции, в том числе иммунного ответа, и репарация тканей. Активность протеаз находится под контролем ингибиторов, одним из важнейших представителей которых является 2МГ. Повышение концентрации 2МГ сдерживает чрезмерное повышение активности протеаз и предотвращает разрушение нативных белков [3]. Известно, что 2МГ находится в тесной связи со многими факторами иммунной системы и выполняет двоякую функцию в реализации иммунного ответа: с одной стороны он является белком-переносчиком, образуя комплексы с антителами и цитокинами, с другой стороны является супрессивным медиатором иммунной системы. Активность 2МГ в ВПК отражает выраженность воспалительной реакции в переднем отрезке глаза.
Увеит вызвал увеличение концентрации продуктов метаболизма NO (нитратов и нитритов) в ВПК на 3 сутки в 2,1 раза. По мере стихания воспаления их концентрация снижалась и на 7 сутки достигла уровня нормы. Оксид азота обладает широким спектром биологического действия. При увеличении его концентрации при воспалении происходит расширение сосудов, что способствует выходу биологически активных веществ из плазмы крови в ткани. Оксид азота оказывает мощное противоинфекционное действие. При этом он может оказывать и цитотоксический эффект, который обусловлен действием сильнейшего окислителя пероксинитрита, образующегося в результате взаимодействия оксида азота с супероксид-анион радикалом (О2•-) [1].
Таким образом, при данном способе моделирования наблюдается классическая картина острого увеита, сопровождающаяся выраженными изменениями биохимических показателей в слезе и ВПК. Резкое возрастание концентрации белка в ВПК и увеличение числа лейкоцитов свидетельствует о нарушении гематоофтальмического барьера и повышенной проницаемости сосудов. Снижение антиокислительной активности и активности СОД в слезной жидкости и ВПК говорит о развитии выраженного окислительного стресса и об истощении эндогенного пула антиоксидантов. Повышение уровня 2-макроглобулина также как и увеличение числа лейкоцитов отражают степень остроты воспалительного процесса. Известно, что синтез 2- макроглобулина при воспалении увеличивается, что является фактором, сдерживающим чрезмерную активацию протеолитических ферментов. Лейкоциты мигрируют в зону воспаления и содержание этих клеток в тканях коррелирует с выраженностью воспалительного процесса. Увеличение концентрация нитратов и нитритов в ВПК также указывает на остроту воспалительного процесса при увеите, поскольку NO, метаболитами которого они являются, участвует как в механизме расширения кровеносных сосудов и повышении их проницаемости, так и в цитотоксических реакциях. Следует отметить, что изменения биохимических показателей в ВПК сохранялись дольше, чем в слезной жидкости. Все наблюдаемые изменения соответствуют основным звеньям патогенеза воспалительного процесса в глазу.
Список литературы
1. Ванин А.Ф. Оксид азота в биологии: история, состояние и перспективы исследований // Биохимия. 1998; 63(7): 867-9.
2. Гулидова О.В., Любицкий О.Б., Клебанов Г.И., Чеснокова Н.Б. Изменение антиокислительной активности слезной жидкости при экспериментальной ожоговой болезни глаз. Бюлл. экспер. биол. и мед. 1999; 128(11): 571-4.
3. Зорин Н.А., Зорина В.Н., Зорина Р.М., Левченко В.Г. Универсальный регулятор - 2-макроглобулин. Клиническая лабораторная диагностика. 2004; 11: 18-22.
4. Катаргина Л.А., Сидорова Т.В., Чеснокова Н.Б., Кузнецова Т.П. Клиническое значение антиокислительной активности сыворотки крови и слезной жидкости при эндогенных увеитах у детей. Вестн. офтальмол. 2003; 2: 20-1.
5. Катаргина Л.А., Хватова А.В. Эндогенные увеиты у детей и подростков. М. 2000. 320с.
6. Костюк В.А., Потапович А.И., Ковалева Ж.В. Простой и чувствительный метод определения активности супероксиддисмутазы, основанный на реакции окисления кверцетина. Вопр. мед. хим. 1990; 2: 88-91.
7. Нероев В.В., Давыдова Г.А., Перова Т.С. Моделирование иммуногенного увеита у кроликов. Бюлл. экспер. биол. мед. 2006; 142(11): 598-600.
8. Чеснокова Н.Б., Кузнецова Т.П. Исследование суммарной активности трипсиноподобных протеиназ и антипротеолитической активности в слезной жидкости при воспалительных заболеваниях глаз для выбора рациональной терапии. Метод. рек. М. 1995.
9. Baldwin H.A., Borgmann A.R. An Improved Immunogenic Uveitis Test in Rabbits for Evaluation of Anti- inflammatory Compounds. Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 1970; 133: 1326-30.
10. Green L.C., Wagner D.A., Glogowski J. et al. Analysis of nitrate, nitrite, and [15N] nitrate in biological fluid. Annal. Biochem. 1982; 126: 131-8.
11. Lowry O., Rozebrough N., Farr A., Randell R. Protein mеasurement with the folin phenol reagent. J. Biol. Chem. 1951; 193: 265-75.
12. Pittman K.M., MacMillan-Crow L.A., Peters B.P., Allen J.B. Nitration of manganese superoxide dismutase during ocular inflammation. Exp. Eye Res. 2002; 74(4): 463-71.
