МИКРОРАЗМНОЖЕНИЕ IN VITRO ПОЛИПЛОИДНЫХ СОРТОВ ШЕЛКОВИЦЫ

Единственным и полноценным кормом для гусениц тутового шелкопряда является лист шелковицы. Кормовая база тутового шелкопряда в современных условиях – это специальные плантации шелковицы с определенной схемой посадки и типом формовки в соответствии с направлениями их использования. Для успешного развития шелководства необходима высокопродуктивная кормовая база, что предусматривает наличие технологичных, экономически эффективных плантаций шелковицы, постоянно  восполняющихся новыми высокоурожайными болезнеустойчивыми растениями [1].

Размножение шелковицы в промышленных масштабах традиционным путем весьма затратно. Поэтому все большее значение приобретает использование для этих целей микроклонального размножения in vitro [2]. В основе метода лежит уникальная способность растительной клетки – давать начало целому растительному организму [3].

Микроклональное размножения in vitro позволяет получать: оздоровленный материал в больших количествах, планировать выпуск растений к определенному сроку, длительно хранить пробирочные растения и создавать «банк» ценных форм и сортов [4]. Поэтому микроразмножение может стать перспективным направлением восполнения кормовой базы тутового шелкопряда и обеспечения саженцами шелковицы в промышленных масштабах.

В ФГБНУ «Научно-исследовательская станция шелководства» изучением, сохранением и улучшением кормовой базы тутового шелкопряда занимаются с 70-х годов прошлого века, но размножение кормовой шелковицы проводилось традиционными методами. В связи с перспективностью микроразмножения in vitro для ускоренного расширения и улучшения сортимента кормовой шелковицы, исследования в последнее время направлены на изучение особенностей микроклонального размножения полиплоидных сортов шелковицы российской селекции.

Для наших исследований были отобраны вызревшие однолетние побеги со здоровой верхушечной почкой 2-х полиплоидных сортов шелковицы российской селекции: ПС-109,4п (тетраплоид) и Надежда (триплоид), произрастающие на кормовой плантации ФГБНУ Шелкстанция. Испытуемые высокопродуктивные сорта, имеют сложное видовое происхождение: Надежда ([Morus multicaulus х Morus alba] х Morus bombycis) и ПС-109,4п ([Morus alba х Morus Kagayamae] х Morus alba). Данные сорта традиционным путем вегетативно трудноразмножаемые. Побеги для микроразмножения были взяты с деревьев 10-летнего возраста в 2 срока: март и август. Срезанные побеги промывали в проточной воде, дезинфицировали в 96% этиловом спирте в течение 30 секунд, далее в 5% растворе гипохлорита кальция в течение 8 минут, затем промывали дистиллированной водой. С подготовленных побегов срезали верхушечные почки с частью побега длиной 0,3см (эксплантат). Для опыта от каждого сорта было взято по 60 почек. Отобранные и подготовленные эксплантаты были вертикально помещены в питательную среду. Питательная среда контрольного варианта (базовая) Мурасиге-Скуга (MС) с добавлением 30г/л сахарозы и 7г/л агар-агара. Уровень pH среды перед застудневанием агар-агаром – 5.8. В опытных вариантах к базовой питательной среде были добавлены 500мг аскорбиновой кислоты, 1,5мг/л 6- бензиламинопурина (6-БАП) и 0,3мг/л 2.4-дихлорфеноксиуксусной кислоты (2.4-Д). После раскрытия почек, появившиеся микропобеги пассировались каждые 45 дней в той же питательной среде. Для стимулирования роста адвентивных побегов после второго пассажа микропобеги были высажены в питательную среду, следующего состава: MС с добавлением 0,5мг/л α-нафтилуксусной кислоты (НУК). Для стимулирования образования корней у побегов была использована следующая питательная среда: MС с добавлением 1,0мг/л индол-3-масляной кислоты (ИМК). Исследуемые образцы культуры содержались при температуре +27˚С под светом флуоресцентной лампы с 16ч фотопериодом. Для сравнения 2-х питательных сред были сформированы следующие варианты 1,3,5,7 как базовые, 2,4,6, и 8 как опытные. Сравнение проводили между сортами: варианты 1,2,5,6 для сорта Надежда, 3,4,7,8 – для сорта ПС-109,4п, а также между сезонами высадки эксплантатов: варианты 1-4 – март, варианты 5-8 – август. Наблюдения за образцами фиксировались каждый 7 дней в течение 4-х месяцев с расчетом процентного выхода раскрывшихся почек для 2-х периодов высаживания. Через 4 месяца культивирования проводили подсчет и измерение длинны основного (центрального) и придаточных микропобегов. Наблюдение за образованием корней у опытных образцов проводили только в 1-4 вариантах (мартовская высадка). Исследования проводились в лабораторных помещениях Шелкстанции по общепринятой методике.

В результате проделанной работы были получены следующие результаты: погруженные в питательную среду срезанные почки (эксплантаты) испытуемых сортов начали раскрываться в марте на 6-9 день после высаживания. 100%-ный выход раскрывшихся почек имели эксплантаты триплоидного сорта Надежда в весенний период вегетации в опытной среде (вариант 4). в базовой среде (контроль) раскрывшихся почек было на 19,6% меньше. В образцах тетраплоидного сорта ПС-109,4п высокий результат наблюдался в аналогичной питательной среде (93,5%), при этом в базовой – развитие получили лишь 61,1% эксплантатов. Однако в августовский период наблюдений (5-8 варианты), независимо от состава питательных сред и генотипа исследуемых сортов, почек раскрылось меньше на 13,4-57,4%, наименьшая разница в опытном варианте у образцов триплоидного сорта Надежда (Табл.1).

Таблица 1  

Характеристика сортов шелковицы по раскрытию почек при микроразмножении in vitro

Из Табл.1 видно, что развитие почек при размножении in vitro зависит не только от периода высаживания образцов, состава питательной среды, но и от сорта, что указывает на связь сезона раскрытия почек шелковицы в условиях in vitro с генетической предрасположенностью и комбинацией фитогормонов. Это подтверждается высказыванием некоторых авторов, что реакция на микроразмножение in vitro шелковицы зависит от генотипа и сезона [2].

На 2-м этапе работы, когда проросшие почки были пересажены из чашек Петри в пробирки, в период первого пассажа появились микропобеги, из которых определяли основной (центральный) и несколько придаточных. Центральный микропобег у сорта Надежда был длиннее, чем у сорта ПС-109,4п (1,9 и 0,9 см, соответственно). В дальнейших наблюдениях было отмечено, что независимо от количества пассажей, как центральный, так и придаточные микропобеги у сорта Надежда были длиннее, чем у сорта ПС-109,4п на 0,7 и 0,1см соответственно. Также следует отметить закономерность между двумя пассажами: после первой пересадки количество придаточных микропобегов сократилось у обоих сортов относительно срока высадки, что указывает на зависимость реакции на микроразмножение от сезона и, возможно, от генотипа (Табл.2).

Таблица 2  

Характеристика микропобегов при размножении in vitro.

Наблюдение за корнеобразованием проводилось только в мартовский период эксперимента (Табл.3).

Таблица 3

Показатели по укоренению микропобегов шелковицы в весенний период

Образование и рост корней были достигнуты с помощью разрастания базальной части микропобегов, при этом наблюдалась разница в их развитии между сортами и составом питательной среды: показатели по триплоидному сорту Надежда как по выходу, так и по средней длине корня выше, чем у тетраплоидного сорта Пс-109,4п, наша модификация базовой среды, также дала положительный результат.

Таким образом, результаты наших исследований подтверждают преимущество триплоидных сортов при микроклонировании шелковицы независимо от сезона их размножения и состава питательной среды.

Следует отметить, что использование микроразмножения in vitro для решения проблемы промышленного тиражирования шелковицы имеет свои особенности, в основном связанные с возможностями морфогенетического потенциала сортов шелковицы, сезоном высадки, а также с подбором оптимальной питательной среды.

Список литературы

1.     Богословский В.В., Лейнвебер Е.Ф., Селионова М.И. Биологические и продуктивные особенности разноплоидных сортов кормовой шелковицы и их использование для разносезонных выкормок тутового шелкопряда // Доклады Российской академии сельскохозяйственных наук. 2011. № 1. С. 54-57.

2.     Бартиш И.В. Разработка метода органогенеза из мезофильной ткани для некоторых сортов и клоновых подвоев яблони // Тез. докл. II Российского симпозиума «Новые методы биотехнологии растений». – Пущино. 1993. С.116.

3.     Бурдасов В.М., Ильина Е.И., Коннова Н.В. Особенности микроклонального размножения яблони // V Междунар. конф. «Биология культивируемых клеток и биотехнология»: Тез докл. – Новосибирск. 1988. С. 360.

4.     Короховой В.И., Бартиш И.В., Состав культуральной среды и эффективность образования побегов in vitro из листовых эксплантов яблони // Физиология растений. 1997. №3. С. 440-444.

5.     Тарашвили З.Т., Высоцкий В. А. Микроразмножение здорового посадочного материала ягодных культур // Садоводство. 1982. №2. С.22-23.