ПОЛИИММУННАЯ ПЛАЗМА С ПОВЫШЕННЫМИ УРОВНЯМИ ДЕФЕНЗИНОВ - ПЕРСПЕКТИВНЫЙ КОМПОНЕНТ ДОНОРСКОЙ КРОВИ

Проведено исследование 88 образцов донорской плазмы, приготовленных по стандартной технологии. Методом твердофазного иммуноферментного анализа (тест-системы HyCult biotechnology) в этих образцах обнаружены дефензины в широком диапазоне концентраций (56 – 280 нг/мл), наиболее существенные значения имела полииммунная плазма доноров III группы (200 нг/мл и более). Предлагается использовать донорскую полииммунную плазму в лечении различных инфекционных заболеваний и осложнений основного патологического состояния.
Ключевые слова: врожденный иммунитет, антибактериальные белки, альфа-дефензины полииммунная плазма, бактерии, инфекция.
Введение. Агрессия внешних инфекционных антигенов (микробных, вирусных и других) всегда сопровождается иммунозащитным ответом макроорганизма, сложным и, как правило, согласованно действующим при участии соответствующих звеньев клеточного и гуморального иммунитета. В последние десятилетия повышенное внимание исследователей уделяется антимикробным пептидам дефензинам (Human Neutrophils Peptides - defensins), кателицидинам, гистатинам - компонентам передовой линии иммунной защиты [11]. Наиболее изученными из них являются дефензины - катионные пептиды, имеющие молекулярную массу 3-
6 кД, обладающие широким спектром активности в отношении грамположительных и грамотрицательных бактерий, оболочечных вирусов и грибов. Механизм действия дефензинов весьма сложен, полностью не изучен. Установлено, что такие белки продуцируются полиморфноядерными лейкоцитами, естественными киллерами, клетками эпителия, кожи, дыхательных путей, желудочно-кишечного тракта, мочеполовой системы [8]. Альфа- дефензины (α-defensins) синтезируются на стадии промиелоцита в костном мозге [6]. В гранулах зрелых нейтрофилов содержится значительное количество дефензинов и их синтез не происходит.
Доказано участие дефензинов в регуляции хемотаксиса, выработке цитокинов и активации системы комплемента. [12], то есть их функционирование скоординировано с механизмами антигенспецифического антимикробного гуморального и клеточного иммунитета.
В процессе фагоцитоза инфекционных антигенов в клетке (гранулоците) азурофильные гранулы, содержащие дефензины, сливаются с фагоцитарными вакуолями, создавая высокую концентрацию дефензинов [1].
Выделение дефензинов из естественных киллеров стимулируется бактериальными антигенами. Индукция бета-дефензинлов (β-defensins) связана с функцией фактора некроза опухоли, а также интерлейкином, γ- интерфероном.
Дефензины являются связующим звеном между врожденным (неспецифическим) и приобретенным иммунитетом, занимают важное место в регулировании хемотаксиса моноцитов, Т-лимфоцитов и незрелых дендритных клеток. Бета-дефензины активируют Т-лимфоциты памяти, альфа-дефензины являются хемоатракантами для моноцитов, Т-лимфоцитов. Доказано наличие связи между экспрессией антимикробных дефензинов и активностью антиген специфических иммунных реакций [1, 9]. Однако полный механизм регулирования содержания дезенфинов в крови человека не раскрыт. Тем не менее можно предположить наличие информативности показателей активности альфа- и бета-дефензинов для оценки состояния специфических иммунных реакций.
Прямое взаимодействие дефензинов с внешними инфекционными антигенами у человека реализуется за счет их структуры, т.е. наличия кластеров положительно заряженных аминокислот. Дефензины содержат аргинин в количестве основной катионной аминокислоты. Высокое содержание аргинина, лицина, гистидина обеспечивает носительство дефинзинами положительного электрического заряда. Четкое чередование гидрофильных и гидрофобных участков (зон) молекул дефензинов способствует их встраиванию в фосфолипидный слой мембраны микроорганизмов, что ведет к разрушению клеток – носителей антигенов. Нельзя не учитывать факт активации системы комплемента как основного механизма разрушения инфекционных антигенов [5].
Противовирусного действия дефензинов предопределяется прямым их взаимодействием с оболочками вирусов (так же, как и с клеточными мембранами бактерий и грибов). Кроме того дефензины оказывают непрямое противовирусное действие, взаимодействуя с инфицированными клетками человека [1]. Альфа1– дефензины обладают прямым противовирусным эффектом в отношении вирусов простого герпеса 1 и 2, гепатитов, ВИЧ. В тоже время они не способны повреждать вирусы, не имеющие липидной оболочки.
Проблема выделения отдельных фракций дефензинов в качестве чистых препаратов не решена в связи с ограниченным их количеством у человека (для получения товарной продукции). Однако, она может быть решена методами синтеза препаратов, моделирующих функции отдельных белков этой группы [2, 7]. Данное направление исследований уже реализуется на стадии разработки, клинической апробации и внедрения отдельных предложенных препаратов.
Цель исследования. Изучить информативность показателей содержания альфа-дефензинов в крови доноров как способа выявления образцов донорской плазмы, обладающих клинически значительным иммунокоррегирующим действием. На первом этапе работы еѐ задачей было выявление образцов плазмы с повышенным содержанием альфа-дефензинов и тестирование их антимикробной активности.
Материалы и методы. Обследованы 88 активных доноров (мужчин) в возрасте от 21 до 34 лет систематически cдающих компоненты крови в отделении автоматического афереза. Пробы крови тестировались на наличие гепатитов В и С и ВИЧ–инфекцию, включая ПЦР–диагностику на автоматизированном ПЦР– комплексе Roche на этапе медицинского освидетельствования доноров. Подготовка проб выполнялась по методу C.D. Agostino et al [6] с последующим хранением при -70 градусов Цельсия в полипропиленовых пробирках. Исследования проб проводилось после их оттаивания твердофазным иммуноферментным методом с использованием коммерческих наборов НК317-02 (альфа-дефензины 1-3) фирмы HyCult biotechnology. Бактерицидную активность определяли общепринятым методом [4].
Результаты и обсуждение. Установлено, что у всех обследованных (100%) выявляются альфа-дефензины в количестве от 56 нг/мл до 280 нг/мл (Табл.1).
                                                                                                                             Таблица 1

Содержание альфа-дефензинов 1-3 в плазме доноров г.Cанкт–Петербурга

Как следует из этой таблицы у 75% обследованных (66 человек) содержание альфа-дефензинов составляют от 56 до 100 нг/мл, у 14,8% (13 чел.) колебалось от 100 до 200 нг/мл, у 10,2% (9 чел.) более 200 нг/мл. Известно (Табл.2), что минимальная повреждающая концентрация дефензинов в отношении грамположительных и грамотрицательных бактерий и грибов рода Candida варьируют от 1,8 мкг/мл (E.coli) до 250 мкг/мл (P.mirabilis, C.albicans).
Исходя из конкретных обстоятельств потребности в иммунокоррегирующей терапии представляется возможность выбирать образцы иммунной плазмы, активные в отношении соответствующих инфекционных агентов.
                                                                                                                            Таблица 2

 Активность дефензинов в отношении бактерий и некоторых грибов рода Candida (цит. по В.И. Мамчур, А.Э. Левых [1])

Примечание: *МПК - минимальная подавляющая концентрация

Заключение. Наш опыт лабораторного тестирования активности антимикробных пептидов в плазме активных донором свидетельствует о перспективности рассматриваемого направления при выборе образцов плазмы, как это предлагается в методических рекомендациях НИИ ГИТ ФМБА России [3], обладающих лечебными антимикробными свойствами, обусловленными как дефензинами, так и повышенным содержанием иммуноглобулинов.

Список литературы

1. Мамчур В.И., Левых А.Э. Дефензины – эндогенные пептиды с антиинфекционными и противоопухолевыми свойствами // Болезни и антибиотики. – 2012. – Т.2, №7, C.315–321.
2. Литвиненко А.А. Роль иммунокоррекции в комплексном лечении рака молочной железы // Здоровье женщины. – 2012, №1, C.134–137.
3. Получение новых гемокомпонентов (плазма, лейковзвесь) из крови доноров-носителей естественных антибактериальных антител против грамотрицательной микрофлоры и их применение для лечения гнойно- септических заболеваний хирургического профиля (Мельникова В.Н., Чеботкевич В.Н., Волкова С.Д. и др.) // Метод. рекомендации № 97/124, – Санкт-Петербург. – 1998. – 20 с.
4. Слоним А.А., Толчеев Ю.Д. Определение бактерицидной активности сыворотки крови и лимфы // Лаб. дело. - 1989. - № 7. - С.65-66.
5. Ярилин А.А. Иммунология.Учебник.- М.: ГЭОТАР–Медиа, 2010.- 752 с.
6. Arnljots K., Sorensen O., Lollike K., Borregaard N. Timing, targeting and sorting of azurophil granule proteins in human myeloid cells // Leukemia.- 1998.- Vol.12, P.1789-1795.
7. Cobo E.R., Chadee K. Antimicrobial human Alpha-Defensins in the colon and their role in infectious and non- infectious diseases // Pathogens. – 2013. – Vol.2. – P.177–19.
8. D‘Agostino C., Lichtner M., Mastroianni C.M. et al. In vivo release of alpha-defensins in plasma, neutrophils and CD8 T-lymphocytes of patients with HIV infection // Current HIV Research. – 2009. – Vol.7. – P.650–655.
9. Defensins: natural component of human innate immunity // Human Immunology. – 2013. – Vol. 74, №9. – P.1069–1079.
10. Schuerholz Т., Branderburg K., Marx G. Antibacterial peptides and their potential application in inflammation and sepsis // Critical Care. – 2012, – Vol.16, P.207–213.
11. Ślebioda Z., Szponar E., Kowalska A. Defensins and their role in the maintenance of the oral cavity homeostasis – a literature review // Centr. Eur. J. Immunol. – 2013. – Vol.38, №1. – P.111–117.
12. van den Berg R.H., Faber-Krol M.C., van Wetering S. et al. Inhibition of activation of the classical pathway of complement by human neutrophil defensins // Blood. – 1998. – Vol.92, №10.- P.3898-3903.