ИСПОЛЬЗОВАНИЕ МЕТОДА ДИЭЛЕКТРОФОРЕЗА В ОПРЕДЕЛЕНИИ СТАДИЙ КОЛОРЕКТАЛЬНОГО РАКА

Поиск новых подходов и методов верификации диагноза, чувствительных маркеров при колоректальном раке остается «задачей номер один» [6]. С этой точки зрения весьма интересны структурно-функциональные параметры эритроцитов. Данные литературы свидетельствуют, что эритроцит можно рассматривать как универсальную модель для изучения изменений цитоплазматических мембран и метаболизма клеток организма [1, 5]. С другой стороны, возникающее на фоне неопластической трансформации при колоректальном раке напряжение эритроидного ростка кроветворения приводит к декомпенсации эритропоэза, изменению состояния мембран эритроцитов, нарушению микрореологических свойств крови, что усиливает явления гипоксии, осложняя течение основного заболевания [4].
Цель исследования: выявить особенности электрических, вязкоупругих параметров эритроцитов в зависимости от стадии колоректального рака для определения возможностей их использования в диагностике заболевания с акцентом на ранние стадии.
Материалы и методы.
Исследованы эритроциты и сыворотка крови у 36 пациентов (19 женщин и 17 мужчин) в возрасте от 47 до 65 лет с колоректальным раком и 20 лиц группы сравнения (условно здоровые) сопоставимого возраста.
Из 36 пациентов у 18 больных диагностирован рак прямой кишки, у 12 – рак анального канала, у 6 больных выявлены первично множественные опухоли (рак сигмовидной и прямой кишки). У 20 пациентов опухоль диагностирована в поздних стадиях (Т3-4), у 16 в стадии Т1-2. Наличие метастазов (в область печени) выявлено у 8 пациента, у остальных больных метастазирование не было выявлено. Степень вовлеченности лимфоузлов у большей части пациентов была не определена Nх, у 9 она соответствовала N1, у одного N0. Шесть пациентов были обследованы в динамике проводимой комбинированной терапии.
Всем пациентам были выполнены общеклинические, биохимические исследования, проведены ренгеноскопия, колоноскопия с биопсией, ультразвуковое исследование, у 24 МРТ органов брюшной полости. Диагноз был верифицирован основании клинического, биохимического и инструментальных исследований.
В качестве группы сравнения рассматривались практически здоровые обследуемые (20 человек), из них - 11 мужчины и 9 женщин в возрасте от 35 до 60 лет, средний возраст 47+5 лет, у которых не было выявлено онкологических заболеваний, иной патологии внутренних органов.
Всем обследуемым было проведено изучение показателей биохимии, красной крови стандартными методами [7].
Электрические, вязкоупругие параметры эритроцитов методом диэлектрофореза (ДЭФ) [3] в неоднородном переменном электрическом поле (НПЭП) с помощью автоматизированной специализированной установки [2]. Оценивали электропроводность мембран, индексы агрегации и деструкции эритроцитов, емкость мембран клеток, скорость движения эритроцитов к электродам, положение равновесной частоты, амплитуду деформации эритроцитов, поляризуемость клеток, обобщенные показатели вязкости и жесткости, величины индуцированного дипольного момента.
Для компьютерной обработки данных использовался пакет оригинальных программ CELLFIND. Ошибка воспроизводимости метода – 7-12%.
Статистическая обработка данных выполнена с использованием программы SPSS, ver.10. Достоверность различия показателей оценивали по критериям Стьюдента, Пирсона (при нормальном распределении), в случаях отклонения распределения от нормального использовались непараметрические критерии (U-критерий Манна- Уитни, Колмогорова-Смирнова).

Результаты.
При анализе показателей красной крови у пациентов с различными стадиями опухоли и после проведенной терапии отмечено достоверное снижение количества эритроцитов, уровня гемоглобина, среднего содержания, концентрации гемоглобина в эритроците, среднего корпускулярного объема клеток, гематокрита от начальных стадий опухоли к терминальным стадиям и состоянию после проведенной терапии (p<0,001- p<0,05). Скорость оседания эритроцитов нарастала от Т1-2 к Т3-4, после проведенной терапии отмечено достоверное снижение СОЭ (Табл.1).
Анализ данных биохимии в группах обследуемых позволил выявить достоверное снижение уровня общего белка, альбуминов, протромбинового индекса у пациентов с КРР, в то время как уровень общего, прямого билирубина, мочевины, креатинина, глюкозы, активность трансаминаз, щелочной фосфатазы, амилазы крови оказались повышенными (p<0,0001-0,05).
При анализе биохимических показателей у пациентов с различными стадиями опухоли и после проведенной терапии отмечено снижение уровней общего белка, альбуминов, протромбинового индекса и повышение активности АМК, ЩФ, уровней прямого билирубина, мочевины и глюкозы по мере нарастания стадии заболевания и после курса проведенной терапии (p<0,0001-0,043).

                                                                                                                            Таблица 1

 Показатели красной крови у больных с различными стадиями колоректального рака, пациентов после проведенной терапии и лиц группы сравнения (M±m).

Примечание 1.
M – средняя арифметическая вариационного ряда, m – средняя ошибка средней арифметической.
*- статистическая значимость отличия от 1 группы (* - p<0,05, ** - p<0,01, *** - p<0,001);
^ - статистическая значимость отличия от 2 группы (^ - p<0,05, ^^ - p<0,01, ^^^ - p<0,001);
$ - статистическая значимость отличия от 3 группы ($ - p<0,05, $$ - <0,02, $$$ - p<0,001).

В отношении уровня активности трансаминаз, общего билирубина, креатинина выявлено нарастание показателей от стадии от Т1-2 к Т3-4 (p<0,0001-0,05), после проведенной терапии отмечена тенденция к снижению вышеописанных показателей, не достигающая уровня достоверности (Табл.2). Следует отметить, что наиболее достоверные различия между группами с начальными и терминальными стадиями заболевания продемонстрировал уровень активности АЛТ (p<0,0001), несколько меньше по степени достоверности – уровень активности АСТ, уровни общего белка, протромбиновый индекс (p<0,01), и, наконец, еще в меньшей степени - уровни альбумина и креатинина (p<0,05). Подобные изменения, вероятно, связаны с выраженностью синдрома цитолиза в терминальной стадии и снижением синтетической функции печени, а также проявлением нарушения функции почек. Стабильность в отклонении биохимических параметров в ходе проведения комбинированного лечения обусловлена, возможно, токсическим действием противоопухолевых препаратов, лучевой терапии.
При использовании метода диэлектрофореза для выявления особенностей электрических и вязкоупругих параметров эритроцитов у пациентов с КРР в зависимости от стадии процесса и проводимой терапии выявились характеристики эритроцитов, наиболее значимые для верификации диагноза.
По мере утяжеления заболевания у больных с колоректальным раком отмечено увеличение полиморфизма клеток красной крови – преобладающими в терминальных стадиях оказались шиповидные, сфероцитарные, деструктивные формы эритроцитов с выраженными явлениями анизо-, пойкилоцитоза и анизохромии (p<0,05).
У пациентов с КРР по мере нарастания тяжести заболевания показатели электропроводности, обобщенные показатели жесткости, вязкости, индексы агрегации, деструкции на всех частотах нарастали, а диаметр клеток, амплитуда деформации на высоких частотах, поляризуемость мембран на частоте 106 Гц, дипольный момент, электрическая емкость мембран эритроцитов достоверно уменьшались (p<0,0001-0,05) (Табл.3).

                                                                                                                             Таблица 2

Показатели биохимии у больных с различными стадиями колоректального рака, пациентов после проведенной терапии и лиц группы сравнения (M±m).

Примечание 1.
M – средняя арифметическая вариационного ряда, m – средняя ошибка средней арифметической.
*- статистическая значимость отличия от 1 группы (* - p<0,05, ** - p<0,01, *** - p<0,001);
^ - статистическая значимость отличия от 2 группы (^ - p<0,05, ^^ - p<0,01, ^^^ - p<0,001);
$ - статистическая значимость отличия от 3 группы ($ - p<0,05, $$ - <0,02, $$$ - p<0,001).

Терминальные стадии опухоли ассоциировались со смещением равновесной частоты в высокочастотный диапазон (p<0,002-0,05). Наиболее достоверные различия в значениях параметров эритроцитов у пациентов с начальными стадиями опухоли от здоровых обследуемых выявлены в отношении амплитуды деформации клеток на высоких частотах, обобщенных показателей вязкости и жесткости, поляризуемости на частоте 106 Гц и дипольного момента (p<0,0001). Наиболее значимыми в отношении дискриминирования различных стадий КРР между собой оказались амплитуда деформации эритроцитов и поляризуемость на частоте 106 Гц, емкость мембран, скорость движения клеток к электродам, положение равновесной частоты и уровни агрегации и деструкции на частоте на частоте 106 Гц (p<0,002-0,007). Получены обратные корреляции стадии заболевания с амплитудой деформации (r=-0,592, p<0,015), прямые – с обобщенными показателями жесткости (r=0,571, p<0,01) и вязкости эритроцитов (r=0,501, p<0,018), индексом агрегации (r=0,644, p<0,001) и деструкции эритроцитов на высоких частотах (r=0,600, p<0,001).
Положительная динамика в ходе проводимой противоопухолевой терапии ассоциирована с нарастанием деформируемости эритроцитов на фоне снижения обобщенных показателей вязкости, жесткости, снижением склонности эрироцитов с деструкции, образованию агрегатов, снижением электропроводности, толщины мембраны, смещением равновесной частоты в низкочастотный диапазон. Клетки с большей скоростью с возросшим дипольным моментом двигались к электродам, повышалась их резистентность к воздействию стрессов высокой интенсивности (p<0,001-0,05). При этом наиболее быстро реагировали на эффект терапии такие показатели эритроцитов, как поляризуемость, электропроводность, емкость мембран и величина дипольного момента (p<0,001).
                                                                                                                             Таблица 3

 Вязкоупругие и электрические характеристики эритроцитов у больных с колоректальным раком различных стадий и в группе сравнения (M±m).

1. M – средняя арифметическая вариационного ряда, m – средняя ошибка средней арифметической.
2. Величина дипольного момента рассчитывалась при напряженности электрического поля 8,85.10-12Ф/м.

Установлены корреляции электрических и вязкоупругих параметров с показателями красной крови и биохимическими параметрами, сила которых нарастала у пациентов в терминальных стадиях КРР. Следует отметить, что количество эритроцитов, уровень гемоглобина высокодостоверно прямо и со значительной силой связи коррелировали с поляризуемостью на частоте 106 Гц (r=0,65; p<0,02; r=0,71; p<0,03) и обратно электропроводностью (r=-0,57; p<0,01; r=-0,62; p<0,014). Количество эритроцитов оказалось обратно связано с обобщенным показателем жесткости (r=-0,65; p<0,02). CКОЭр прямо ассоциирован с емкостью мембран эритроцитов (r=0,51; p<0,05).
Показатели, характерные для синдрома цитолиза (повышение активности индикаторных ферментов АСТ, АЛТ находились в прямой сильной высокодостоверной связи с электропроводностью (r=0,47; p<0,027; r=0,63; p<0,04) и обратной - с поляризуемостью (r=-0,42; p<0,05; r=-0,44; p<0,03).Гипербилирубинемия с повышением как прямой, так и непрямой фракций оказалась прямо связанной с величиной среднего диаметра эритроцитов (для общего билирубина r=0,56, p<0,04; для прямого билирубина r=0,49, p<0,013), уровень непрямого билирубина коррелировал с уровнем гемолиза на высоких частотах (r=0,82, p<0,016).
Биохимические проявления синдрома холестаза (повышение активности экскреторных ферментов ЩФ, ГГТП) находились в обратной достоверной связи с емкостью клеточной мембраны (r=-0,51; p<0,03; r=-0,47; p<0,042); повышение уровня общего холестерина было прямо связано с обобщенными показателями жесткости и вязкости клеток (r=0,65; p<0,05; r=0,70; p<0,02). Гипербилирубинемия ассоциирована с величиной среднего диаметра эритроцитов, как показано ранее.
Синдром печеночно-клеточной недостаточности с проявлениями в виде снижения содержания в сыворотке крови общего белка, особенно альбуминов, протромбина, холестерина оказался обратно достоверно связан с величиной дипольного момента (r=-0,761, p<0,035), скоростью движения клеток к электродам (r=-0,77, p<0,03), амплитудой деформации эритроцитов (r=-0,631, p<0,037).

Выводы.
1. У пациентов с колоректальным раком выявлено снижение количества эритроцитов, уровня гемоглобина, среднего содержания, концентрации гемоглобина в эритроците, среднего корпускулярного объема клеток, гематокрита от начальных стадий опухоли к терминальным.
2. По мере утяжеления заболевания у больных с колоректальным раком отмечено увеличение полиморфизма клеток красной крови с выраженными явлениями анизо-, пойкилоцитоза и анизохромии.
3. Наиболее достоверные различия в значениях параметров эритроцитов у пациентов с начальными стадиями опухоли от здоровых обследуемых выявлены в отношении амплитуды деформации клеток на высоких частотах, обобщенных показателей вязкости и жесткости, поляризуемости на частоте 106 Гц и дипольного момента.
4. Наиболее значимыми в отношении дискриминирования различных стадий колоректального рака между собой оказались амплитуда деформации эритроцитов и поляризуемость на частоте 106 Гц, емкость мембран, скорость движения клеток к электродам, положение равновесной частоты и уровни агрегации и деструкции на частоте на частоте 106 Гц.
5. Установлены параметры эритроцитов, наиболее чувствительные к проводимой терапии: поляризуемость на высоких частотах, электропроводность, емкость мембран и величина дипольного момента

Список литературы

1. Болис Л., Хоффман Д.Ф., Лиф А. Мембраны и болезнь. М.: Медицина, 1980. 408 с.
2. ГенераловВ.М., Бакиров Т.С., Пак А.В., Звольский И.Л., Зайцев Б.Н., Дурыманов А.Г., Кручинина М.В., Курилович С.А., СергеевА.Н. Автоматизированная установка измерения вязкоупругих характеристик эритроцитов // Наукоемкие технологии. 2008. Т. 9. № 12. С. 28-33.
3. Генералов В.М., Кручинина М.В., Дурыманов А.Г., Медведев А.А., Сафатов А.С., Сергеев А.Н., Буряк Г.А., Курилович С.А., Громов А. А. Диэлектрофорез в диагностике инфекционных и неинфекционных заболеваний. - Новосибирск: Изд-во «ЦЭРИС». - 2011. - 172 с.
4. Новицкий В.В., Степовая Е.А., Гольдберг В.Е., Колосова М.В., Рязанцева Н.В., Корчин В.И. Эритроциты и злокачественные новообразования. Томск: ―STT‖, 2000.- 288 с.
5. Новицкий В.В., Рязанцева Н.В., Степовая Е.А. Физиология и патофизиология эритроцита. Томск: Из-во ТГУ, 2004. 202 с.
6. Рак толстой кишки: пер. с англ. под ред. Дж. Мейерхардта, М. Сандерза; ред. Серии А.Т. Скарин. – М.: ООО «Рид Элсивер», 2009. – 186 с.
7. Руководство по лабораторным методам диагностики. // Под ред. проф. Кишкуна А.А. М.: ГЭОТАР-Медиа. 2007. 800 с.