ВЭЖХ-АНАЛИЗ БЕТУЛИНА И β-СИТОСТЕРИНА В ФАРМАЦЕВТИЧЕСКОЙ КОМПОЗИЦИИ В ВИДЕ ПОРОШКА

Аннотация

Разработаны методики установления подлинности и количественного определения бетулина и β- ситостерина методом ОФ-ВЭЖХ. Определены условия пробоподготовки для анализа обоих веществ в фармацевтической композиции в виде порошка, содержащего в качестве вспомогательных веществ крахмал, белую глинуи аскорбат натрия. Выявлены условия хроматографического анализа бетулина (подвижная фаза ацетонитрил—вода 90:10 (υ/υ) в изократическом режиме при скорости потока 1 мл/мин при температуре 40°C, объем инжекции 20 μL, детектирование при длинах волн 206 и 210 нм, время анализа 20 мин) и β-ситостерина (подвижная фаза спирт этиловый 96%-ацетонитрил 15:85 (υ/υ) в изократическом режиме при скорости потока 1 мл/мин при температуре 40°C, объем инжекции 20 μL, детектирование при длине волны 210 нм, время анализа 30 мин).

Ключевые слова: бетулин, β-ситостерин, дерматологическая присыпка. Введение

В настоящее время проблема дерматологических заболеваний является широко распространенной. В частности, особое внимание уделяется поиску новых средств терапии псориаза и нейродермитов.

В качестве действующих компонентов разрабатываемой композиции в виде порошка были выбраны бетулин –   тритерпеновый спирт бересты березы и β-ситостерин – растительный стерин, содержащийся во многих пищевых маслах.

Действие бетулина в составе дерматологических средств обусловлено его структурной схожестью с глюкокортикостероидами. Комплекс бетулин-ГКС-рецептор ингибирует синтез лейкотриенов, простагландинов и других медиаторов воспаления и иммуносупрессии.  Кроме того, бетулину несвойственны побочные эффекты глюкокортикостероидов [4]. Противовоспалительное действие тритерпеноида подтверждено в экспериментах [1]. Кроме того, бетулин проявляет антиоксидантный и репаративный эффекты. Антиоксидантная активность бетулина в некоторых работах определялась по уровню активности каталазы, супероксидисмутазы, глутaтион-8- трaнсферазы, глутатионпероксидазы, и продуктoв окисления липидoв [3].

Структура фитостеринов близка к холестерину, это и обуславливает их действие в составе местных дерматологических средств. Холестерин включен в межклеточное пространство церамидов и свободных жирных кислот. Он поддерживает структуру эпидермиса. Растительные стерины способны вместо холестерина встраиваться в мембрану эпидермиса. Фитостерины способствуют дифференцировке клеток и угнетают неоангиогенез, улучшают структуру кожи, препятствуя разрушению волокон и протеогликанов ферментами. Также фитостерины обладают иммуномодулирующей и противовоспалительной (β-ситостерин) [14] активностью. Эти свойства также объясняются структурной схожестью с глюкокортикостероидами. Кроме того, β-ситостерин в составе лекарственной формы используется как вектор доставки бетулина; он способен улучшать состояние кожи при псориазе, регулируя липидный обмен в поверхности эпидермиса.

Для предотвращения окислительных процессов, сопровождающихся образованием эпоксидных соединений, в состав лекарственных форм с фитостеринами необходимо вводить антиоксиданты [16]. В качестве такого соединения, не обладающего раздражающим действием, был выбран натрия аскорбат.

Присыпки применяются в дерматологии при острых воспалительных процессах для уменьшения отека и гиперемии [2]. Данную лекарственную форму не рекомендуется применять при мокнущих дерматозах, так как они смешиваются с экссудатом и образующиеся корки провоцируют усиление воспаления в очаге поражения. Присыпки удобны в применении, оказывают поверхностный эффект. В качестве индифферентных веществ в составе порошков используются растительные (крахмалы) и минеральные компоненты (цинка оксид, тальк и др.) в соотношении 1:3.

В настоящее время на современном рынке крайне недостаточно дерматологических средств для лечения псориаза и нейродермитов. Это связано с многофакторностью патологического процесса, особенностями течения заболевания в каждом конкретном случае, большим количеством побочных эффектов известных средств.

Одной из причин, тормозящих разработку новых препаратов, является сложность анализа фитостериновв сложных многокомпонентных ЛС.

Состав порошка (масс. %): бетулин 2.0, β-ситостерин 2.0, левомицетин 2.0, натрия аскорбат 5.0, крахмал 30.0, белая глина до 100.0.

Цель работы - разработка методов идентификации и количественного определения бетулина и β-ситотсерина как действующих веществ в фармацевтической композиции в виде порошка.

Объектами исследования в работе являются бетулин и β-ситостерин.

Материалы и реактивы: бeтулин 98% (Sigma, 473-98-3); β-ситoстерин (чистoта> 95%); ацетoнитрил для хрoматографии сoрт 0 (ТУ 2636-040-44493179-00); аскoрбат натрия мaрки х.ч. (CAS: 134-03-2); этaнол мaрки о.с.ч.; гексaн мaрки х.ч.; водaочищeнная (ФС 42-0324-09), пoлученная на устaновке систeмы oчистки вoды «Elix 3» с кaртриджем Progard («Millipore», France), удeльное сoпротивление менее 0,2 μСм.

Приборы: ВЭЖ-хроматограммы были пoлучены нa ВЭЖ-хрoматографе «LC-20Avp» (Shimadzu, Japan) в обрaщено-фaзовом рeжиме с дeгазатором пoдвижной фaзы, тeрмостатом кoлонки и диoдно-мaтричным дeтектором, колoнкаDiscoveryC18 (25 cmx4.6 mm, 5 μm, Supelco).

Методика пробоподготовки

Навеску порошка массой 2,0 г (точная навеска) растворяют в 100 мл воды, затем добавляют 100 мл гексана. Раствор центрифугируют, надосадочную жидкость пропускают через делительную воронку. Гексановую фракцию упаривают в токе азота досуха, а затем сухой остаток растворяют в 1 мл элюента (смеси этанол: ацетонитрил (15:85) для определения β-ситостерина или смеси ацетонитрил: вода (90:10) для определения бетулина).

Методики хроматографического анализа

Условия хроматографирования бетулина: подвижная фаза ацетонитрил—вода 90:10 (υ/υ) в изократическом режиме при скорости потока 1 мл/мин при температуре 40°C, объем инжекции 20 μL, детектирование при длинах волн 206 и 210 нм, время анализа 20 мин.

Условия хроматографирования β-ситостерина: подвижная фаза спирт этиловый 96%-ацетонитрил 15:85 (υ/υ) в изократическом режиме при скорости потока 1 мл/мин при температуре 40°C, объем инжекции 20 μL, детектирование при длине волны 210 нм, время анализа 30 мин.

Результаты работы и их обсуждение.

В настоящее время имеется большое количество литературных данных по условиям анализа бетулина и фитостеринов как индивидуальных субстанций. Самым распространенным методом анализа данного типа соединений является высокоэффективная хроматография в обращено-фазовом или нормально-фазовом режиме. В качестве детекторов используются ультрафиолетовые, диодно-матричные и флуоресцентные. Некоторые условиях роматографирования субстанций представлены в Табл.1.

Таблица 1 Условия хроматографирования бетулина и фитостеринов по литературным данным [5; 7; 8; 9; 10; 11; 12; 13]

Анализ компонентов в сложных системах может сопровождаться окислением входящих субстанций, поэтому кроме введения антиоксиданта в состав лекарственной формы, при проведении пробоподготовки необходимо избегать жестких условий обработки, а именно, высокой температуры, реагентов, вызывающих деструкцию соединений (сильных окислителей). Учитывая этот факт, при проведении пробоподготовки ЛФ для анализа действующих компонентов, гексановый экстракт упаривают в токе азота.

На Рисунке 1 представлены хроматограммы β-ситостерина и бетулина после проведения пробоподготовки. Времена удерживания β-ситостерина и бетулина составляли соответственно 19.1 и 7.4 минут.

Таким образом, в работе представлены методики установления подлинности и количественного определения бетулина и β-ситостерина в фармацевтической композиции в виде порошка, содержащей в качестве вспомогательных веществ крахмал, белую глину и натрия аскорбат, методом ОФ-ВЭЖХ.

Список литературы

1.      Карлина М.В., Вавилова А.В. Изучение противовоспалительных свойств суспензии бетулина // Мат. науч.- практ. конф. сотрудников и студентов СПбГМА им. И.И. Мечникова, посвящ. 60-летию победы в ВОВ. 20- 30 апреля 2005. – С. 36-37.

2.      Кочергин Н.Г., Петрунин Д.Д. Современный взгляд на проблему выбора лекарственной формы средств наружной терапии // Укр. журн. дерматол., венерол., косметол. 2012. № 4 (47). С. 59-67.

3.      Кузнецова С.А., Титова Н.М., Калачева Г.С. и др. Изучение состава и антиоксидантных свойств гексанового и этанольного экстрактов бересты // Вестник Красноярского государственного университета. Естественные науки. 2005. №2. С.113-118.

4.      Толстиков Г.А., Флехтер О.Б., Шульц Э.Э., Балтина Л.А., Толстиков А.Г. Бетулин и его производные. Химия и биологическая активность // Химия в интересах устойчивого развития. 2005. № 13. С. 1 — 30.

5.      Chen Y.-Z., Kao S.-Y., Jian H.-C., Yu Y.-M., Li J.-Y., Wang W.-H., Tsai C.-W. Determination of cholesterol and four phytosterols in foods without derivatization by gas chromatography-tandem mass spectrometry // Journal of food and drug analysis. 2015. № 23. P. 636-644;

6.      Current Protocols in Food Analytical Chemistry. Analysis of Tocopherols and Tocotrienols D1.5.12 Supplement 4 Contributed. - Zhimin Xu (2002) D1.5.1-D1.5.12 by John Wiley & Sons, Inc

7.      Derakhshan-Honarparvar M., Hamedi M.M., PirouzifardM.Kh. Rice Bran Phytosterols of Three Widespread Iranian Cultivars // J. Agr. Sci. Tech. 2010. Vol. 12. P. 167-172;

8.      Holonec L., Ranga F., Crainic D., Truţa A., Socaciu C. Evaluation of Betulin and Betulinic Acid Content in Birch Bark from Different Forestry Areas of Western Carpathians// Not Bot HortiAgrobo. 2012. №40(2).P. 99-105.

9.      Gül M.K., Egesel C.Ö., Tayyar Ş., Kahriman F. Changes in Phytosterols in Rapeseed (Brassica napus L.) and Their Interaction with Nitrogen Fertilization // Int. J. Agri. Biol. 2007. Vol. 9. № 2. P. 250-253.

10.   Kakade A.N., Magdum C.S. HPLC analysis of β-sitosterol in herbal medicine and vegetable oils // IJPLS. 2012.

Vol. 3. Issue 5. P. 1666-1669.

11.   Lagarda M.J., Garc´ıa-Llatas G., Farr´e R. Analysis of phytosterols in foods // Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 2006. № 41. P. 1486–1496;

12.   Mäeorg E., Lääniste P., Jõudu J., Mäeorg U. Some important aspects of sterol analysis of vegetable oils // Proc. Estonian Acad. Sci. Chem. 2007. № 56(2). P. 59–66.)

13.   Maji A.K., Pandit S., Banerji P. and Banerjee D. Validated RP-HPLC method for simultaneous determination of betulin, lupeol and stigmasterol in asteracanthalongifolianees //Int J Pharm Pharm Sci. Vol 6. Issue 5.P. 691-695.

14.   Safety Assessment of Phytosterols as Used in Cosmetics. Washington DC. 2013. Suite 1200.