08 апреля 2016г.
Аннотация
Разработаны нормы качества бетулоновой кислоты (БК) как потенциальной фармацевтической субстанции по показателям: подлинность, количественное определение и посторонние примеси. Идентификацию БК и основной примеси – бетулонового альдегида (БА), проводили с использованием 1Н–, 13С-ЯМР и ИК- спектроскопии, ОФ-ВЭЖХ и ТСХ, а также качественными реакциями с гидроксиламином солянокислым и ванилиновой пробой на циклопентанпергидрофенантреновый цикл. Количественное определение БК и БА проводили методом ОФ-ВЭЖХ.
Ключевые слова: бетулоновая кислота, идентификация, количественное определение Введение
Бетулоновая кислота относится к природным соединениям лупанового ряда и обладает комплексом важных биологических свойств, таких как иммуностимулирующее, антиоксидантное, гепатопротекторное, гиполипидемическое, противоязвенное, антимикобактериальное, противовоспалительное и противовирусное [7]. БК является наиболее важным соединением для практического синтеза других биологически активных веществ, производных бетулина – кислот, амидов, оксимов, эфиров и др. Установлено, что биотрансформация всех производных бетулина в организме проходит через образование БК, что доказывает её наибольшую эффективность. Тем не менее, БК до сих пор не является субстанцией для производства лекарственных средств.
Для анализа производных циклопентанпергидрофенантрена практически отсутствуют химические методы, их определение проводят трудоемкими физико-химическими методами, такими как ИК-, ЯМР- и масс- спектроскопия, ОФ-ВЭЖ- и тонкослойная хроматография и т.д.
В связи с существующими проблемами в этой области остро встает вопрос поиска методик фармацевтического анализа бетулина и его призводных.
Целью работы является разработка норм качества бетулоновой кислоты как потенциальной фармацевтической субстанции по показателям: подлинность, количественное определение, посторонние примеси.
Экспериментальная часть
Методы исследования и приборы: ИК-спектры были сняты на ИК-спектрофотометре с преобразователем Фурье «IR Prestige-21» (Shimadzu, Japan) в области 4000-500 см-1 в виде смесей с KBr; ВЭЖ-хроматограммы были получены на ВЭЖ-хроматографе «LC-20Avp» (Shimadzu, Japan) в обращено-фазовом режиме с дегазатором подвижной фазы, термостатом колонки и UV-vis-детектированием, колонка Discovery C18 (25 cm x 4.6 mm, 5 μm, Supelco); спектры ЯМР 13С и 1H регистрировались на ЯМР-спектрометре «Agilent DD2 400» (Agilent Technologies, USA) в DMSO-d6, CDCl3 и D2O на рабочей частоте 101 и 400 МГц соответственно.
Получение бетулина
Бетулин (Б) получали из бересты березы повислой (бородавчатой) – Betula Рendula Roth.
200 г абсолютно сухой измельченной бересты (АСБ) смешивали с 2 л метил-трет-бутилового эфира (МТБЭ), смесь нагревали до температуры кипения (~55 °С) и выдерживали в течение 4 ч. После этого смесь фильтровали и экстрагировали МТБЭ (3 ´ 50 мл), затем экстракт концентрировали, отгоняя МТБЭ на вакуумном испарителе. К полученному остатку добавляли 400 мл 1 %-ного раствора NaOH и нагревали. К щелочному раствору при той же температуре добавляли 600 мл воды и нагревали в течение 1 ч до выпадения осадка. Водный слой сливали, а твердый влажный осадок сушили на воздухе. Получали 48,0 г бетулина – сырца (выход 24 % от массы АСБ). Затем дважды перекристаллизовывали из изопропанола. Получали Б 99.5 %-ной чистоты в виде белых игольчатых кристаллов. Т. пл. 260 – 261 °С, Rf 0.17.
Физико-химические характеристики бетулина соответствовали литературным данным [3]:
Синтез БК как стандарта для ТСХ и ОФ-ВЭЖХ-анализа
3 г (10 ммоль) K2Cr2O7 растворяли в 20 мл воды
при
нагревании, добавляли 9,2 г гранул
Al2O3 (Sуд
= 800 м2
/г) и 5 мл концентрированной H2SO4. Полученный реактив выдерживали на водяной бане при 20-25°С в течение 10 мин (окислительная смесь).
1.5 г (3.4 ммоль) Б растворяли в 138 мл ацетона, обрабатывали УЗ при частоте 44 кГц в течение 1 – 2 мин до образования молочно-белой суспензии. Смесь выдерживали при 25°С в течение 15 мин при интенсивном перемешивании.
Окислительную смесь
добавляли к приготовленной суспензии Б в ацетоне и перемешивали в течение 1.5 ч. Надосадочную жидкость декантировали от гранул Al2O3 с осадком, приливали к
ней
500
мл воды. Всплывающие при этом белые хлопья отфильтровывали. Полученный осадок промывали водой (6 ´ 50 мл) и сушили при температуре 105±5 0С.
Методика определения карбонильного числа
Солянокислый гидроксиламин (4 г) растворяли в 8 мл воды и разбавляли 80 мл этилового спирта. При перемешивании добавляли 60 мл (0.5 моль/л) спиртового раствора гидроксида калия и 10 мл раствора бромфенолового синего и быстро фильтровали.
В колбу помещали 2 г испытуемого соединения, содержащего
кетон (БК или БА), приливали 75 мл раствора гидроксиламина и кипятили смесь 1 ч на водяной бане. По охлаждении титровали избыток основания раствором соляной кислоты (0.5 моль/л) до перехода фиолетовой окраски в жёлтую. Одновременно проводили контрольное определение. Разница между двумя определениями указывает на количество гидроксиламина, израсходованного на оксимирование группы С=О. Так как 1 моль гидроксида калия эквивалентен 1 молю гидроксиламина, то расход гидроксида калия служит непосредственной мерой содержания кетона в соединении [1].Карбонильное число рассчитывали по формуле:
где Vx – объем хлористоводородной кислоты, пошедшей на титрование контрольного раствора, мл; Vn – объем хлористоводородной кислоты, пошедшей
на титрование исследуемого раствора, мл; а – навеска испытуемого соединения, г.
Определение неорганических примесей методом атомно абсорбционной спектрометрии (ААС)
Качественное определение примеси хрома, вольфрама и молибдена в БК проводили электротермическим методом
с использованием ламп с полым катодом на соответствующие
элементы при λ = 358 нм
(Cr), 255 нм (W) и 313 нм (Mo) в газовой среде аргона. Объем пробы – 20 μL.
Результаты
работы
Для идентификации примеси БА в субстанции БК нами был синтезирован образец
сравнения окислением Б системой K2Cr2O7 – H2SO4,
импрегнированной на SiO2 в соответствии с методикой. [4]
Идентификацию неорганических примесей проводили методом ААС, а органических примесей – методом
тонкослойной хроматографии (ТСХ). Примеси элементов Cr, W и Mo обнаружены не были.
Разделить
тритерпеновые
соединения
методом ТСХ очень сложно
в
виду их
близкой
химической структуры.
В Табл.1 приведены значения Rf,
полученные в различных условиях проведения ТСХ-анализа.
Нами были апробированы несколько методик ТСХ-анализа производных бетулина. Так, в методике, описанной Льюи (H. Liu) [5], используются ТСХ-пластины на основе силикагеля марки Merck GF254, а в качестве элюента смесь гексан: этилацетат = 80:20 и дихлорметан: метанол = 98:2. Проявителем служит раствор Ce(SO4)2 (75 г) и (NH4)6Mo7O24 · 4H2O (4г)
в 500
мл
10%-ной H2SO4. Данная методика дает возможность проанализировать смесь бетулина, бетулинового и бетулонового альдегидов, бетулиновой и бетулоновой кислот. [5]
В нашем эксперименте использовалось проявление ТСХ-пластин парами йода. Полученные результаты показали,
что
независимо от проявителя
величины Rf для изучаемых тритерпеноидов в данной системе
элюентов были близки. Следовательно, условия анализа по Льюи могут быть использованы для идентификации примесей как в ходе мониторинга реакций окисления Б, так и для анализа целевого продукта.
В методике ТСХ-анализа по Фелфолди-Гава (A.Felfoldi-Gava) [6] используются алюминиевые пластинки (10 см х 20 см), покрытые слоем силикагеля (0,2 мм) 60F254. Исследуемые образцы растворяют в метаноле и, отступая от нижнего края 1 см, вручную наносят пробу полосами по 10 мм. Смесь н-гексан: этилацетат = 2:1 используют в качестве подвижной фазы. Проявителем является 0.2%-ный раствор Ce(SO4)2 в 0,1 М H2SO4 (10 мин, 120°С). [6] В экспериментах по методике Фелфолди-Гава нами также были использованы пары йода в качестве проявителя, при этом полученные значения Rf для
изучаемых тритерпеноидов были близки: 0.47 для бетулина;
0.50 для бетулиновой
кислоты, 0.75 для лупеола. Рекомендовано использовать β-ситостерол как эталон сравнения, для которого значение Rf равно 0.56. Методику Фелфолди-Гава предпочтительно использовать для анализа бетулина, выделенного из бересты березы,
и его главной примеси - лупеола.
Для разделения исходного Б и БК удобна ТСХ-методика Ковач-Бешович (E.E. Kovač-Bešović) [2] с более полярным элюентом. Подготовка пробы заключается в растворении 50 мг исследуемого вещества в 10 мл метанола, 20 мкл полученного раствора наносят на ТСХ-пластинку с силикагелем GF254 «Merck» (Durmsttadt, Germany). Элюентом служит смесь бензол - этилацетат - муравьиная кислота (36:12:5), проявляют пластины 4- метоксибензальдегидом в серной кислоте. [2] Нами был модифицирован состав элюента: гексан - этилацетат - муравьиная кислота (20:5:1) и проявитель заменен на пары йода. Показано, что в предложенных условиях достигалось лучшее разделение исследуемых тритерпеноидов: Rf Б = 0.30, Rf БК = 0.50.
Наличие БА, как основной примеси, в БК устанавливали по карбонильному числу, который рассчитывали по реакции взаимодействия гидроксиламина солянокислого с карбонильными группами БА и БК. (Схема 1)
Для соединений с одной карбонильной группой (БК) К.Ч.теор. = 70; а с двумя карбонильными группами (БА) К.Ч.теор. = 140.
Таким образом, рассчитанное карбонильное число для
субстанции БК должно быть не
более 73,5 (примесь БА не более 5%).
Идентификация БК
БК определяли качественной реакцией на стероидный или циклопентанпергидрофенантреновый цикл с ванилином (малиновое окрашивание). (Схема 2)
Также идентификацию БК проводили методами 13С-ЯМР-, 1Н-ЯМР-, ИК-спектроскопии и ОФ-ВЭЖХ. Характеристики полученных спектров представлены ниже (Табл.2, 3).
Таблица 2
Характеристика полного 13C-ЯМР
спектра БК, (CDCl3,
δ, м.д.)
|
С1
|
39.6
|
С2
|
34.1
|
С3
|
216.5
|
С4
|
47.3
|
С5
|
55.0
|
С6
|
19.6
|
|
С7
|
33.6
|
С8
|
40.7
|
С9
|
49.9
|
С10
|
36.9
|
С11
|
21.4
|
С12
|
25.5
|
|
С13
|
38.5
|
С14
|
42.5
|
С15
|
30.5
|
С16
|
32.1
|
С17
|
56.2
|
С18
|
49.2
|
|
С19
|
46.8
|
С20
|
150.3
|
С21
|
29.7
|
С22
|
37.0
|
С23
|
26.6
|
С24
|
21.0
|
|
С25
|
16.0
|
С26
|
15.8
|
С27
|
14.6
|
С28
|
177.3
|
С29
|
109.5
|
С30
|
19.4
|
Таблица 3
Характеристика полного 1Н-ЯМР
спектра БК, (CDCl3, δ, м.д.)
|
3H, 24-CH3
|
0.80 с
|
комплекс, CH2, CH
|
1.02 – 1.95
|
|
3H, 23-CH3
|
0.84 с
|
3H, 30-CH3
|
1.64 с
|
|
3H, 27-CH3
|
0.98 с
|
1H, 19-H
|
2.97 м
|
|
3H, 25-CH3
|
1.00 с
|
1H, 29-H
|
4.57 с
|
|
3H, 26-CH3
|
1.02 с
|
1H, 29-H
|
4.70 с
|
1Н и 13С ЯМР-спектры соответствовали спектрам стандартов.
Подлинность БК также устанавливали по температуре плавления и поляризуемости: Т. пл. 250 – 252 0С, [α]D20+12,2° (с 0.09, CHCl3), которые совпадали с литературными данными. Кроме того, подлинность подтверждалась характеристиками масс-спектра: m/z (Iотн., %):
454 (58) [M]+,
248 (64), 219 (42), 205 (76), 189 (88), 136 (100), 121 (90).
ВЭЖ-хроматограмма, полученная при количественном определении БК приведена на Рисунке 1. Время выхода пика 6,65 мин соответствует БК.
Количественное определение БК
Количественное определение проводили методом ОФ-ВЭЖХ-анализа. По стандартным растворам с концентрацией 150, 100 и 50 % от предполагаемой искомой концентрации был построен калибровочный график. Рассчитанное по площади пика испытуемого раствора содержание БК соответствовало нормам.
Количественное определение остаточных органических растворителей в субстанции БК проводили методом ГЖХ. Их
содержание соответствовало требованиям ОФС «Остаточные органические растворители» ГФ XII.
Таким образом, в работе представлены результаты разработанных норм качества на бетулоновую кислоту как потенциальную фармацевтическую субстанцию, проявляющую высокую биологическую активность (противоопухолевую, противовирусную, гиполипидемическую, гепатопротекторную и др.).
Список литературы
1. Бауер, К. Анализ органических соединений / К. Бауер; под ред. А.Д. Петрова. – Москва: Изд-во иностр. лит–ры, 1953. – 488 с.
2.
Пат. 2184120 Российская
Федерация, МПК C07J53/00, C07J63/00. Способ получения бетулина / В.И. Рощин; заявитель и патентообладатель. В.И. Рощин, Н.Ю. Шабанова, Д.Н. Ведерников ; авторы. – № 2001103062/04; заяв. 02.02.01 ; опубл. 27.06.02, Бюл. № 18. – 3 с.: ил.
3.
Пат. 2270202 Российская Федерация, МПК C07J53/00, C07J63/00. Способ получения бетулина и лупеола / Институт органической химии Уфимского научного центра РАН (RU); заявитель и патентообладатель. М.С. Юнусов, Н.Г. Комиссарова, Н.Г. Беленкова; авторы // № 2004122279/04; заяв. 19.07.04; опубл. 20.02.06, Бюл. № 25.
– 7
с.: ил.
4.
Komissarova N.G., Belenkova N.G., Spirikhin L.V., Shitikova O.V., Yunusov M.S. Selective oxidation of betulin by Cr (VI) reagents // Chemistry of Natural Compounds. 2002. Vol. 38. № 1. P. 58 – 61.
5.
Liu J., Fu M.L., Chen Q.H. Biotransformation optimization of betulin into betulinic acid production catalysed by cultured Armillaria luteo-virens Sacc ZJUQH100 – 6 cells // Journal of Applied Microbiology. 2010. Vol. 110. Р. 90–97.
6.
Monaco P. Isoprenoids from the leaves of Quercus suber // Journal of Natural Products. 1984. Vol. 47. № 4. Р. 673– 676.
7.
S.R. Paia, M.S. Nimbalkarb, N.V. Pawarc, G.B. Dixita. Optimization of extraction techniques and quantification of Betulinic Acid (BA) by RP-HPLC method from Ancistrocladus heyneanus Wall. Ex Grah // Industrial Crops and Products. 2011. Vol. 34. P. 1458– 1464.
