БИС-НИТРОКСИДНЫЙ МЕТАНОФУЛЛЕРЕН - ПОТЕНЦИАЛЬНЫЙ КОМПОНЕНТ ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ

Аннотация

Изучено влияние 0,001-0,01% бис-нитроксидного метанофуллерена ((NO∙)2-МФ) на эффективность противоожоговых мазей с ксимедоном.

Биомиметическое  исследование  влияния  ксимедона  на  (NO∙)2-МФ  проведено  с  использованием ленгмюровских монослоев. Двухкратное увеличение молекулярной площади А0 (NO∙)2-МФ под действием ксимедона (с 0,88 до 1,70 нм2·молекула-1), вероятно, обусловлено интенсивным взаимодействием нитроксидного фрагмента с ксимедоном.

Показано, что время полного заживления мазями с ксимедоном в присутствии (NO∙)2-МФ сократилось с 14 суток (ксимедон) до 12 суток. Одновременно увеличилась антиоксидантная активность ферментов (15 дней): каталазы с 2,7 (ксимедон) до 3,8 (ксимедон плюс (NO∙)2-МФ) ммоль·мин-1·μг-1белка, а активность СОД - с 1700 (ксимедон) до 2200 (ксимедон плюс (NO∙)2-МФ) ммоль·мин-1·μг-1белка. Показатели активности каталазы и СОД, позволяют сделать вывод о дoстоверном влиянии антиоксидантнoй активнoсти ксимедона в комплексе с (NO∙)2-МФ на прoцесс заживления гнойных ран мягких тканей.

Высказано предположение, что нитрoксидный фрагмент в (NO∙)2-МФ, наряду с фуллереновым кором, являющимся «радикальной губкой», существенно улучшает антиоксидантные свoйства ЛС, перевoдя компoненты в бoлее активную фoрму.

Ключевые слова: бис-нитроксидный метанофуллерен, ксимедон, лечение ожогов. Введение

Лечение ожоговых ран является одной из наиболее актуальных проблем в комбустиологии, имеющей не только медицинскую, но и социально-экономическую значимость. Традиционная терапия поверхностных ожогов направлена на снижение выраженности патологических процессов, быстрейшее восстановление микроциркуляции, активацию антиоксидантной системы и стимуляцию репаративных процессов [1, 2]. Таким образом, разработка новых лекарственных средств (ЛС) для лечения ожоговых ран, в том числе и антиоксидантного действия, является актуальной задачей.

Одним из таких препаратов с доказанной антиоксидантной активностью в клинической практике является ксимедон, широко использующийся в медицине как иммуномодулятор с регенерантным и репарантным действием. В большинстве случаев антиоксидантные эффекты ксимедона доказываются по его способности активировать ферментные системы в организме человека, тогда как прямыми исследованиями in vivo и in vitro эти свойства явно не проявляются.

В отличие от этого, производные фуллерена являются представителями класса «радикальных губок» за счет легкости присоединения свободных радикалов к молекуле фуллерена. Доказано, что бис-нитроксидный метанофуллерен (NO∙)2-MФ в биологических системах способен выступать в роли антиоксиданта [3]. Кроме этого, он проявляет свойства супероксиддисмутазы (СОД), улавливая супероксиданион радикал [3]. Следовало ожидать синергетический эффект усиления антиоксидантных свойств ксимедона в присутствии (NO∙)2-MФ при наружном воздействии.

Целью работы является повышение эффективности мазей с ксимедоном для лечения гнойных ожоговых ран за счет введения в композицию бис-нитроксидного метанофуллерена.

Объектами исследования выступают ксимедон (1–(β-оксиэтил)-4,6-диметил-1,2-дигидро-2- оксипиримидина) и бис-нитроксидный метанофуллерен.

Экспериментальная часть

Бис-нитроксидный малонатный метанофуллерен (61-бис-(О-2,2,6,6-тетраметил-4-оксипиперидинил- оксил)-61-метано[60]-фуллерен) синтезирован и охарактеризован методами УФ, ИК, 31Р, 1Н, 13С ЯМР спектроскопией, MALDI TOF масс-спектроскопией в Институте органической и физической химии им. А.Е. Арбузова Казанского научного центра РАН [4]; Ксимедон (1-(β-оксиэтил)-4,6-диметил-1,2-дигидро-2- оксопиримидин), НПП ФГУП «Кристалл», г. Дзержинск Нижегородской области.

Состав мази: ксимедон – 10 г, левомицетин – 0,75 г, полиэтиленоксиды: PEO-1500 - 19,05 г, PEO-400 – 76,1 г, бис-нитроксидный метанофуллерен ((NO∙)2-МФ) - 0,1 г.

Приборы: Электронные спектры поглощения были получены на приборе «Bio line Specord S-100» (Analytik Jena, Germany) в области 190-600 нм, толщина кварцевой кюветы 10 мм; Тензиометрические измерения и получения изотерм сжатия π-А проводили на установке состоящей из тефлоновой ванны и весов Ленгмюра (KSV Nima) c использованием деионизованной воды при pH 5,5 субфазы и 20±1°С. Поверхностное давление π =γ0-γ, где γ0 и γ [мН·м-1] – поверхностное натяжение до и после нанесения монослоя. Молекулярную площадь A0 (NO∙)2-МФ определяли графически в точки пересечения линейной части π–A изотермы и горизонтальной оси.

Фармакологическую активность композиции исследовали в соответствии с руководством по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ (А.Н. Миронов, 2012) на крысах-самцах линии Вистар массой (M±s) 200±2,6 г. Контактный термический ожог нанесен под наркозом (площадь – 20% поверхности тела). После моделирования термической травмы животным основной группы в течение 10 дней на раневую поверхность наносили фармацевтическую композицию.

Активность супероксиддисмутазы (СОД) оценивали методом Т.В. Сироты [Вопросы мед. химии. 1999]. В

кювету помещали 2 мл бикарбонатного буфера (рН 10,65) и 0,1 мл 0,1% раствора адреналина. После добавления 0,01 мл исследуемого раствора, содержимое кюветы быстро перемешивали и измеряли величину оптической плотности при 347 нм в течение 3 мин. В контрольную пробу раствор не добавляли. Общую активность фермента (Е) вычисляли по формуле:

Е(%ингибирования) = [1 – (ΔDопыт/ΔDконтроль)]∙100%,

где ΔDопыт и ΔDконтроль – скорости реакции аутоокисления адреналина, соответственно, в присутствии и отсутствии гомогената. Активность СОД выражали в условных единицах. За 1 условную единицу принимают 1% ингибирования.

Каталазную активность в ткани оценивали с использованием метода H.Aebi (1970), основанное на способности пероксида водорода давать стабильное окрашивание с молибдатом аммония.

Результаты работы и их обсуждение.

Взаимодействие бис-нитроксидного метанофуллерена (NO∙)2-MФ изучено на модели ленгмюровских монослоев. Эта модель позволяет биомиметически исследовать межмолекулярные взаимодействия нитроксидного фрагмента молекулы в монослое, так и молекул монослоя с ксимедоном в водном растворе - субфазе на основании изучения изотерм сжатия. Молекулярная плотность монослоя легко контролируется на границе раздела фаз «воздух-вода» по величине предельной молекулярной площади А0,lim (NO∙)2-MФ.

При нейтральных pH (pH 5-7) А0,lim (NO∙)2-MФ равна 0,86 нм2, что близко к теоретически рассчитанной (0,78 нм2) [5]. Считается, что нитроксилсoдержащая группа пoгружена в воду, а два фуллереновых цикла двух

молекул (NO∙)2-MФ остаются связанными между собой [6].

На Рисунке 1 продемонстрирована зависимость предельной молекулярной площади А0 (NO∙)2-МФ от концентрации ксимедона, по виду соответствующая изотерме ленгмюровского типа с выходом на плато в области 1,70 ± 0,02 нм2.

Модуль сжатия монослоев Cs-1 в области плато, равный 187 мН/м, практически не изменился, что характеризует пленку (NO∙)2-МФ с адсорбированным ксимедоном как эластичную. Таким образом, биомиметическое изучение влияния ксимедона на (NO∙)2-МФ в ленгмюровских монослоях характеризует интенсивное взаимодействие нитроксидного фрагмента с ксимедоном. Двухкратное увеличение молекулярной площади А0,lim (NO∙)2-МФ, вероятно, обусловлено силами отталкивания N-оксоаммониевых катионов.

Антиоксидантные свойства были проверены в экспериментах на крысах при лечении ожоговых ран 10% ксимедоновой мазью. Данные эксперимента подтвердили улучшение антиоксидантных свойств мази ксимедона в присутствии (NO∙)2-МФ (Табл.1).

Моделирование гнойной раны сопровождалось местной хирургической инфекцией с признаками гнойного отделяемого из раны, локального повышения температуры, отека, гиперемией кожи в области раны. Стенки и дно раневого дефекта были покрыты фибринозно–гнойным налетом, наблюдалась инфильтрация окружающих тканей.

В ходе лечения у животных трех групп наблюдались изменения локального статуса – oчищение ран от гнoя и некрoзoв и запoлнение их грануляциoнной тканью с однoвременным исчезнoвением местных и региoнарных признакoв вoспаления. Однакo, отмечалoсь дoстoверное сoкращение срoкoв грануляции и oчищения раны в оснoвной группе пo сравнению с кoнтрoльными.

Таким образoм, изучение показателей активности каталазы и СОД при лечении гнойных ожоговых ран мaзями на основе ксимедона и (NO∙)2-МФ, позволяет сделать вывод о дoстоверном влиянии антиоксидантнoй активнoсти ксимедона в комплексе с (NO∙)2-МФ на прoцесс заживления гнойных ран мягких тканей. Высказано предположение, что нитрoксидный фрагмент в (NO∙)2-МФ спосoбен улучшать антиоксидантные свoйства ЛС, перевoдя компoненты в бoлее активную фoрму.

 

Список литературы

1.      Кузин М.И., Сологуб В.К., Юденич В.В. Ожоговая болезнь. Москва. 1982. С.159.

2.      Пахомов С.П. Хирургия ожогов у детей. Нижний Новгород. 1997. С. 208.

3.      Пиотровский Л.Б., Киселев О.И. Фуллерены в биологии // Сев.-Зап. отд-ние Рос. Акад. Мед. Наук. – СПб.: ООО «Издательство Росток». 2006. С.49.

4.      Gubskaya V.P., Berezhnaya L.Sh., Gubaidullin A.T., Faingold I.I., Kotelnikova R.A., Konovalova N.P., Morozov V.I., Litvinov I.A., Nuretdinov L.A. Synthesis, structure and biological activity of nitroxide malonate methanofullerens // Org. Biomol. Chem. 2007. №5. P. 976-981.

5.      Wang P., Shamsuzzoha M., Wu X.L., Lee W.S., Metzger R.M. Order and disorder in fullerene (C60) Langmuir- Blodgett films: direct imaging by scanning tunneling microscopy and high-resolution  transmission electron microscopy // J. Phys. Chem. 1992. Vol. 96. P. 9025-9028.

6.      Melnikova N.B., Gulyaev I.V., Gulenova M.V., Volkov A.A., Zimnyakova O.E., Gubskaya V.P., Berezhnaya L. Sh., Gubaidullin A.T. Structure of surface films of malonate mono- and dinitroxyl methanofullerenes // Russ. Chem. Bull, Ser. chem. 2008. №9. P. 1920-1931.