07 апреля 2016г.
Целью настоящего исследования явилось определение чувствительности клинических изолятов хламидофил – возбудителей респираторного хламидиоза – к ряду макролидных антибиотиков и сопоставление результатов тестирования с результатами антихламидийной терапиии.
Материалы и методы
Для достижения поставленной цели мы провели 4-летний мониторинг (2012-2015 годы) чувствительности хламидофил, выделяемых от военнослужащих, больных респираторными инфекциями, находившихся на лечении в военно-врачебных учреждениях Республики Казахстан, к макролидным антибиотикам посредством динамического культурального исследования антибиотикорезистентности культивируемых клинических штаммов.
Культивирование Chlamydophila pneumoniae осуществляли на культуре клеток линии McCoy, которые выращивали на пластиковых матрасах на 75 см2 (Sarstedt Inc., США) при 36°C в среде RPMI 1640 (ICN Pharmaceuticals Inc., США) с добавлением 10% сыворотки эмбрионов коровы (ICN Pharmaceuticals Inc., США), 20 мМ HEPES (ICN Pharmaceuticals Inc., США) и 2 мМ глютамина (ICN Pharmaceuticals Inc., США).
Визуализацию и подсчёт хламидийных включений производили с помощью микроскопа Zeiss Axiolab (Германия) при 200-кратном увеличении, используя меченные флюоресцеином видоспецифические моноклональные антитела (Chlamyset antigen, Orion Diagnostica, Финляндия).
С целью получения большого количества хламидий, необходимых для тестирования чувствительности к антибиотикам, производили от 5 до 10 пассажей клинических изолятов. Как минимум два последних пассажа проводили без добавления антибиотиков.
Для тестирования чувствительности к антибиотикам использовали 96-луночные планшеты (Starstedt Inc., США); клетки McCoy вносили в планшеты в количестве около 104 на лунку и инкубировали в течение 24 часов при 36°C в 5% CO2. Клетки заражали хламидиями в разведении, при котором образовывалось приблизительно 103 включений на монослой (20-40 включений в поле при 200-кратном увеличении). Планшеты
центрифугировали при 1700 g в течение 1 часа и инкубировали при 36°C в 5% CO2 в течение 2 часов. Затем содержимое лунок удаляли и вносили в лунки инкубационную среду, содержащую соответствующие концентрации антибиотиков; каждую концентрацию тестировали в двух лунках. В качестве контроля использовали две лунки, в которые добавляли инкубационную среду без антибиотиков. После этого планшеты инкубировали при 36°C в 5% CO2 в течение 72 часов, затем клетки фиксировали 96% этанолом в течение 10 мин, отмывали фосфатно-солевым буфером и окрашивали флюоресцирующими антителами.
Штаммы хламидиофил по отношению к испытываемым препаратам считали чувствительными в случае, если при концентрации антибиотика, соответствующей таковой в крови при назначении пациенту среднетерапевтических доз, не наблюдалось ни одного типичного хламидийного включения.
Для оценки чувствительности к макролидным антибиотикам штаммов хламидофил, выделенных от военнослужащих, определяли минимальную подавляющую концентрацию и минимальную бактерицидную концентрацию изучаемых препаратов для всех изолятов.
Минимальную подавляющую концентрацию (МПК) определяли как наименьшую концентрацию антибиотика, при которой не наблюдалось ни одного типичного включения, МПК90 – как наименьшую концентрацию антибиотика, при которой наблюдалось уменьшение количества включений на 90% и более по сравнению с контролем. Минимальную бактерицидную концентрацию (МБК) определяли как наименьшую концентрацию антибиотика, при которой не наблюдалось ни одного типичного включения после пассажей без антибиотиков.
Результаты
Самая низкая чувствительность у Chlamydophila pneumoniae наблюдалась к эритромицину и в несколько большей степени к азитромицину и рокситромицину. Наиболее выраженная чувствительность отмечалась у хламидофил к джозамицину, спирамицину и кларитромицину. Изучение антибиотикочувствительности C. pneumoniae к макролидам в динамике (2012-2015 гг.) показало, что на протяжении всего периода наблюдения количество хламидофил, резистентных к ним (выраженное как в абсолютных, так и относительных величинах), остаётся неизменным в пределах нормальных колебаний значений признака, за исключением азитромицина и кларитромицина, по отношению к которым в многолетней динамике наблюдалось увеличение относительного числа резистентных штаммов.
Результаты тестирования антибиотикочувствительности клинических изолятов C. pneumoniae, выделенных от больных респираторным хламидиозом до лечения, по МПК и МБК изучаемых препаратов суммированы в Табл.1.
Из таблицы видно, что значения МПК и МБК варьируют в очень широких пределах для всех антибиотиков. Напротив, значения МПК90 всех антибиотиков находятся в очень узком диапазоне, что указывает на резкое уменьшение хламидийных включений (на 90% и более) при близких концентрациях антибиотика.
Значения МБК незначительно превышают МПК (в 1,7 раза для большинства антибиотиков), за исключением эритромицина (МБК превышает МПК в 14 раз) и джозамицина (МБК превышает МПК в 4,6 раза).
Таблица 1
Чувствительность к макролидным антибиотикам клинических изолятов C. pneumoniae
|
Антибиотик
|
МПК
|
МПК90
|
МБК
|
|
Азитромицин
|
0,02-5,6*
0,14 мг/л**
|
0,02-1,12*
|
0,02-5,4*
0,24**
|
|
Джозамицин
|
0,02-5,12
0,03 мг/л
|
0,02-0,08
|
0,02-5,0
0,14
|
|
Кларитромицин
|
0,02-3,2
0,03 мг/л
|
0,02-1,0
|
0,02-3,2
0,06
|
|
Рокситромицин
|
0,08-6,1
1,3 мг/л
|
0,02-2,1
|
0,08-5,4
2,2
|
|
Спирамицин
|
0,5-18,2
1,2 мг/л
|
0,5-1,0
|
0,5-18,2
2,0
|
|
Эритромицин
|
0,06-6,4
0,2 мг/л
|
0,06-0,2
|
1,0-5,8
2,8
|
* - диапазон;
** - среднее значение.
На наш взгляд, подобное несоответствие между МПК и МБК может приводить к развитию хронической (персистирующей) хламидийной инфекции, несмотря на клиническую эффективность антибиотика. При этом под воздействием подавляющих доз антибиотика размножение хламидофил в макрофагах приостанавливается на промежуточной стадии между элементарными и ретикулярными тельцами (о чём свидетельствует отсутствие хламидийных включений в первых генерациях при пассаже с МПК антибиотика с появлением элементарных телец при последующих пассажах без включения антибиотиков в культуральную среду). По-видимому, под влиянием недостаточных для полной элиминации возбудителя доз антибиотика образуются так называемые “аберрантные” ретикулярные тельца, которые продуцируют минимальные количества хламидийных структурных антигенов (что не позволяет диагностировать хламидийный инфекционный процесс с помощью существующих методов серологической диагностики), но продолжают синтезировать мембранный белок стрессового клеточного ответа, БТШ-60, что приводит к аутосенсибилизации организма хозяина, которая имеет значение при таких заболеваниях как ишемическая болезнь сердца (кардио-васкулярный хламидиоз) и болезнь Рейтера
