ВЛИЯНИЕ НИЗКИХ ДОЗ БИСФЕНОЛА А НА СТЕПЕНЬ КОМПАКТИЗАЦИИ ХРОМАТИНА В КУЛЬТУРАХ КЛЕТОК ЧЕЛОВЕКА

Введение

Бисфенол А (БФА) – органическое синтетическое соединение впервые было получено в 1891 российским химиком А. Дианиным. С 1950 года БФА стал широко применяться в промышленности в качестве отвердителя в производстве поликарбонатных пластиков и полистирольных смол. В настоящее время из-за возросших объемов использования пластмассовых изделий и различных упаковок, покрытых эпоксидными смолами, БФА в большом количестве попадает в окружающую среду, питьевую воду и продукты питания. В связи с этим воздействие БФА на живые организмы происходит постоянно и в разных дозах, что имеет свои негативные стороны, т.к. это вещество по своей структуре имеет сходство с женскими половыми гормонами (эстрогенами) [Иванов и др., 2013; vom Saal et al., 2007].

На протяжении нескольких десятилетий во всем мире активно проводятся исследования влияния различных доз БФА на живые организмы. Было обнаружено, что этот ксеноэстроген оказывает отрицательные воздействия на организм человека и животных. БФА является одной из причин возникновения онкологических заболеваний, болезней нервной (нарушение нейрогенеза, инсульты, болезнь Паркинсона), сердечно-сосудистой (ишемическая болезнь сердца, гипертоническая болезнь, нарушение свертываемости крови), эндокринной (диабет, ожирение) и репродуктивной (нарушения гаметогенеза, полового цикла, эндометриоз, изменения в молочной и предстательной железах, яичках) систем. Кроме того, этот экотоксикант приводит к задержкам развития в пренатальный и неонатальный периоды, вызывает психические расстройства у человека (тревожность, депрессии, гиперактивность, агрессию) и отклонения в поведении у потомков животных, подвергшихся воздействию БФА [Kundakovic et al., 2013; Huang et al., 2014; Mileva et al., 2014; Eichenlaub-Ritter, Pacchierotti, 2015; Santangeli et al., 2016; Ma et al., 2017].

Вопрос о молекулярных механизмах, посредством которых БФА оказывает негативное влияние на организм человека и животных, остается открытым. В настоящее время общепризнано, что БФА действует одновременно в качестве эндокринно-активного соединения и как агент, который приводит к эпигенетическим/эпигеномным отклонениям от нормы. Оба механизма не являются взаимоисключающими, хотя эпигенетические механизмы действия БФА (в частности изменение метилирования ДНК и компактизация хроматина) изучены очень плохо [Паткин и др., 2012; Паткин, Софронов, 2015; Thayer, Belcher, 2011; Acconcia et al., 2015]. В связи с этим цель данной работы состояла в количественной оценке полногеномной степени компактизации хроматина в культурах клеток человека при воздействии различных доз БФА.

Материалы и методы

Были исследованы линии клеток человека HepG2 (гепатоцеллюлярная карцинома), IMR-32 (нейробластома) и FetMSC (мезенхимные стволовые клетки из костного мозга) (Российская коллекция клеточных культур Института цитологии Санкт-Петербург) [Полянская и др. РККК].

Культивирование монослойных клеточных линий человека. Все клетки культивировали при 370С в СО2-инкубаторе в атмосфере 5 % CO2 в 25 см2- культуральных вентилируемых флаконах («Jet Biofil») в среде DMEM (для FetMSC в DMEM/F12) с добавлением 10% эмбриональной бычьей сыворотки («Биолот»),

20 ед/мл антимикотиков («Gibco»), 100 ед/мл пенициллина («Биолот») и 100 мкг/мл стрептомицина («Биолот») в течение 24 часов до достижения клетками 25-30% конфлюентности. Затем в опытные образцы добавляли раствор ДМСО (конечная концентрация 0.02%) либо смесь ДМСО с БФА (конечные концентрации БФА 0.25 мкМ, 0.5 мкМ, 1 мкМ, 10 мкМ; ДМСО 0.02%). ДМСО был использован в качестве растворителя БФА. Контрольные пробы (интактные - без токсикантов) и опытные образцы продолжали культивировать еще в течение 72 часов. Снятие культуры клеток проводили с помощью раствора трипсин- Версена (1:3), суспензию клеток переносили в пробирки для последующего выделения ядер. Для каждой линии клеток было проведено не менее трех независимых опытов.

Получение и обработка ядер ДНКазой I. Для получения ядер из исследуемых клеточных культур суспензию клеток центрифугировали при 800g 5 мин. Надосадочную жидкость полностью удаляли и добавляли теплый гипотонический раствор (0.50% KCl), который составлял 7-10 объёмов от размера осадка. Клетки ресуспендировали и инкубировали при 370С в течение 30 мин. Центрифугировали при 1000g 5 мин. Гипотонический раствор удаляли и осадок ядер ресуспендировали в 30-50 мкл 1х PBS. Концентрацию ядер оценивали с помощью камеры Горяева (в среднем концентрация ядер была 103 – 105/мкл). Суспензию хранили при -20 0С.

Определение относительной степени полногеномной компактизации хроматина с помощью ДНКазы          I и ImageJ анализа (Genome-wide Chromatin State DNaseI Sensitive Assay, GWChS-DNase-SA). Данная методика является модифицированным вариантом классического биохимического подхода, основанного на чувствительности ДНК к ДНКазе I [Кирьянов, 1983; Ling, Waxman, 2013], с использованием современного программного обеспечения ImageJ [Rasband, 1997-2015; Abramoff et al., 2004]. Обработку хроматина (~104 ядер/проба) ДНКазой I проводили в 30 мкл реакционной смеси (10 mМ Tris-HCl, pH 7.5 при 250С; 2.5 mМ MgCl2; 0.1 mМ СaCl2; 0,009 ед/мкл ДНКаза I) («Thermo Scientific») в течение 5 минут при +150С. Для одного и того же исследуемого образца ядер в опыт брали два варианта: проба с ДНКазой I и проба без фермента. Контролем полноты обработки ДНКазой I служил образец ДНК соответствующей клеточной линии (в количестве 1000 нг/проба). Реакцию останавливали добавлением 1/10 объема 0.5 М ЭДТА и инкубировали во льду в течение нескольких минут. Затем из этих образцов выделяли ДНК с помощью протеиназной обработки и однократной депротеинизацией раствором хлороформ:изоамиловый спирт (24:1, v/v). Верхнюю фазу, содержащую нуклеиновые кислоты, переносили в новую центрифужную пробирку и добавляли РНКазу А (конечная концентрация 8 мг/мл). Инкубировали при +370С в течение 60 минут. Далее следовала стандартная процедура осаждения ДНК с помощью этанола. Осадок ДНК высушивали в термостате при +370С в течение 30 - 60 минут. ДНК растворяли в 18 мкл бидистиллированной воды.

ЭлектрофорезДНКвагарозномгелеиденситометрическийанализэлектрофореграммc помощью программногообеспеченияImageJ. Электорофорез образцов ДНК после обработки ДНКазой I проводили в горизонтальных пластинах 1,0 % агарозного геля на 0.5хТВЕ (44,5 мМ Трис; 44,5 мМ борная кислота, рН 8,0; 1 мМ ЭДТА) в течение 50 минут при силе тока 40mA (напряженность электрического поля составляла 5 В/см). ДНК визуализировали окрашиванием бромистым этидием (1мкг/мл) в течение 15 минут. Просмотр геля осуществляли с помощью УФ-трансиллюминатора и фотографировали на цифровую камеру. Далее проводили количественный анализ полученных изображений с помощью программы ImageJ, где для одного и того же исследуемого образца измеряли интенсивность флюоресценции «шлейфа» ДНК на дорожках для вариантов после обработки ДНКазой I («DNaseI») и в буфере без фермента («buffer»). Площадь измерений для всех проб была одинаковая и включала в себя всю ширину дорожки, начиная с зоны внесения (лунка) геномной ДНК в гель до области нахождения краски для нанесения бромфенолового синего. Значения флуоресценции фона из измерений были исключены. Относительные значения степени компактизаци хроматина получали отношением абсолютных значений для лунки «DNaseI» к значению для «buffer». Для каждой дорожки делали по 5 измерений. Затем для опытных образцов с неизвестной степенью компактизации хроматина устанавливали относительный уровень гетерохроматинизации, выраженный в процентах, используя коэффициенты уравнения линейной регрессии (y=a+bX), полученные по опорным точкам для 0% гетерохроматина (для этого служили значения «голой» ДНК по 8 экспериментам) и 100% гетерохроматин (1 у.е. флуоресценции ImageJ). Стандартная ошибка для исследуемого образца вычислялась по формуле σ/√N, где N - количество образцов «голой» ДНК, использованных при построении уравнения линейной регрессии; σ-погрешность предсказания формулы.

Статистическаяобработка данных. Статистическую обработку полученных данных проводили с использованием непараметрических критериев Крускала-Уоллиса (Н) и Данна (Q) для попарного сравнения с контрольной группой. Различия считали статистически значимыми при p<0,05 (с учетом поправки Бонферрони на множественность сравнений).

Результаты и обсуждение

C помощью метода GWChS-DNase-SA была проведена полуколичественная оценка степени полногеномной компактизации хроматина в линиях HepG2, IMR32 и FetMSC. Проведенные исследования показали, что после четырех суток культивирования степень гетерохроматинизации в контрольных (интактных) образцах клеточных линий человека HepG2, IMR32 и FetMSC в среднем составляла около 72 %, при этом в линии FetMSC хроматин был более компактизован, чем в линиях HepG2 и IMR32 (Рис.1). Было обнаружено, что 0.02% ДМСО не влияет на степень полногеномной компактизации хроматина. В тоже время культивирование клеток в присутствии 0.02% ДМСО и разных доз БФА в основном приводило к эухроматинизации. Так, степень снижения компактизации хроматина варьировала от 1.1 до 2.4 раза в зависимости от линии клеток и дозы БФА (сравнение с вариантом контроля «0.02% ДМСО»), причем в линиях HepG2 и IMR32 это воздействие характеризовалось колебательной картиной влияния доза-эффект, а именно наблюдаются пики перехода от «эухроматинизации» к «гетерохроматинизации», а затем опять возвращение к «эухроматинизации» (Рис.1). Необходимо отметить, что только в случае дозы 0.25 мкМ БФА и только для линии HepG2 наблюдалось незначительное повышение (примерно в 1.1 раза) степени компактизации хроматина по сравнению с вариантом контроля «0.02% ДМСО».

В нашей работе были исследованы низкие дозы БФА, которые не являются цитотоксичными, как было показано ранее Фик с коллегами [Fic et al., 2013]. Однако этими авторами было обнаружено, что в клетках линии HepG2 после 24 часов воздействия 0,1мкМ и 10мкМ БФА происходит повышение частоты разрывов ДНК, причиной которых могли быть как окислительный стресс, так и эпигеномные изменения, вызванные этим экотоксикантом. Следует отметить, что в настоящее время нет публикаций по исследованию влияния БФА на клеточных линиях IMR32 и FetMSC, но есть данные на других линиях клеток аналогичного происхождения.

Так, для линии нейробластомы SH-SY5Y воздействие низкой концентрацией БФА (0,5 мкМ) в течение 24 часов не приводило к повреждению ДНК, тогда как культивирование с той же дозой БФА в течение 48 часов повышало частоту разрывов ДНК [O’Sullivan, 2017]. Культивирование линии мезенхимальных стволовых клеток человека BMSCs в течение 5 суток с БФА в дозах 0,1 и 1 мкМ повышало пролиферацию клеток через MAPK-сигнальный путь, при этом ингибируя самообновление клеток через ER- сигнальный путь и усиливая адипогенез [Strong et al., 2016]. В настоящее время нет данных об эпигенетических и эпигеномных изменениях в клеточных линиях нейробластомы и мезенхимальных стволовых клеток при воздействии БФА.

Заключение. Низкие дозы бисфенола А влияют на структуру хроматина эукариотических клеток. Воздействие этого экотоксиканта в течение 72 часов в клеточных линиях человека HepG2, IMR32 и FetMSC снижает степень полногеномной компактизации хроматина, т.е. происходит эухроматинизация, что в свою очередь может приводить к активации генов, которые ранее находились в репрессированном состоянии.

*Работа поддержана грантом РФФИ №15-04-04642а

Список литературы

1.        Иванов А.В., Давлетова Н.Х., Тафеева Е.А. Анализ современных представлений о миграции полимерных веществ из упаковки в питьевую воду при хранении и влиянии их на живые организмы// Гигиена и санитария. 2013. №.2. c.25-29.

2.        Кирьянов Г.И. Структура хроматина и энзиматическое метилирование ДНК. Диссертация     на соискание ученой степени д.б.н., Москва. 1983, 258с.

3.        Паткин Е.Л., Павлинова Л.И., Софронов Г.А. Влияние экотоксикантов на эмбриогенез и гаметогенез млекопитающих. Эпигенетические механизмы // Биосфера. 2012. Т.5. № 4. С.450-472.

4.        Паткин  Е.Л.,  Софронов  Г.А.  Эколого-зависимые  заболевания  человека.  Эпигенетические механизмы возникновения и наследования // Медицинский академический журнал. 2015. Т.15. № 3. с. 7-23.

5.        Полянская Г.Г., Сакута Г.А., Еропкин М.Ю., Смирнова Т.Д., Подчерняева Р.Я., Михайлова Г.Р., Дьяконов Л.П., Гальнбек Т.В., Глинских Н.П., Бахарев А.А. Российская коллекция клеточных культур позвоночных (РККК П) Санкт-Петербург, ЦИН РАН, 155 с.

6.        Abramoff M.D., Magalhaes P.J., Ram S.J. Image Processing with ImageJ // Biophotonics International. 2004. V. 11(7). P. 36-42.

7.        Acconcia F., Pallottini V., Marino M. Molecular Mechanisms of Action of BPA // Dose-Response: An International Journal. 2015. P. 1-9.

8.        Eichenlaub-Ritter U., Pacchierotti F. Bisphenol A effects on mammalian oogenesis and epigenetic integrity of oocytes: a case study exploring risks of endocrine disrupting chemicals // BioMed Research International. – 2015, article ID 698795.

9.        Fic A., Žegura B., Sollner Dolenc M., Filipič M., Peterlin Mašič L. Mutagenicity and DNA damage of bisphenol A and its structural analogues in HepG2 cells // Arh Hig Rada Toksikol. 2013. V.64. P. 189-200.

10.     Huang B., Jiang C., Luo J., Cui Y., Qin L., Liu J. Maternal exposure to bisphenol A may increase the risks

of Parkinson’s disease through down-regulation of fetal IGF-1 expression // Medical Hypotheses. 2014. V. 82. P. 245-249.

11.     Kundakovic M., Gudsnuk K., Franks B., Madrid J., Miller R.L., Perera F.P., Champagne F.A. Sex-specific epigenetic disruption and behavioral changes following low-dose in utero bisphenol A exposure // PNAS. 2013. V. 110(24). P. 9956-9961.

12.     Ling G., Waxman D.J. DNase I digestion of isolated nulcei for genome-wide mapping of DNase hypersensitivity sites in chromatin // in Gene Regulation: Methods and Protocols, Methods in Molecular Biology / ed. Minou Bina, 2013. V. 977. Chap.3. P.21-34.

13.     Ma S., Shi W., Wang X., Song P., Zhong X. Bisphenol A exposure during pregnancy alters the mortality and levels of reproductive hormones and genes in offspring mice // BioMed Research International. 2017, article ID 3585809.

14.     Mileva G., Baker S.L., Konkle A.T.M., Bielajew C. Bisphenol A: Epigenetic reprogramming and effects on reproduction and behavior // Int. J. Environ. Res. Public Health. 2014. V. 11. P. 7537-7561.

15.     O’Sullivan S. The cytotoxic and genotoxic effects of bisphenol A on neuronal cells in vitro // The Plymouth Student Scientist. 2017. Vol. 10(1). P. 41-63.

16.     Rasband W.S., ImageJ U. S. National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA, 1997-2015 (http://imagej.nih.gov/ij).

17.     Santangeli S., Maradonna F., Gioacchini G., Cobellis G., Piccinetti C.C., Valle L.D., Carnevali O. BPA- induced deregulation of epigenetic patterns: effects on female zebrafish reproduction // Scientific Reports. 2016. Vol. 6. e21982.

18.     Strong A.L., Miller D.F.B., Buechlein A.M., Fang F., Glowacki J., McLachlan J.A. et al. Bisphenol A alters the self-renewal and differentiation capacity of human bone-marrow derived mesenchymal stem cells // Endocrine disruptors. 2016. V. 4(1). e1200344.

19.     Thayer K. A., Belcher S. Mechanisms of action of bisphenol A and other biochemical/molecular interactions // FAO/WHO expert meeting on bisphenol A (BPA) Ottawa, Canada, 2-5 November 2010, World Health Organization, 2011. 10 p. 

Vom Saal F.S., Akingbemi B.T., Belcher S.M., Birnbaum L.S., Crain D.A. et al. Chapel Hill bisphenol A expert panel consensus statement: Integration of mechanisms, effects in animals and potential to impact human health at current levels of exposure // Reproductive Toxicology. 2007. V. 24. P. 131-138