ИЗМЕНЕНИЕ УРОВНЯ ПОЛНОГЕНОМНОГО МЕТИЛИРОВАНИЯ ДНК В РАЗНЫХ ЧАСТЯХ ТЕЛА МЫШИ НА 12 ДЕНЬ ЭМБРИОНАЛЬНОГО РАЗВИТИЯ

Введение

В настоящее время опубликовано большое количество работ, где отмечается определяющая роль воздействия вредных факторов окружающей среды во время критических периодов онтогенеза (в частности в доимплантационный период эмбрионального развития) в восприимчивости к болезням, возникающим после рождения, в юности и даже в зрелом возрасте. Одним из таких факторов является ксеноэстроген - бисфенол А (БФА), входящий в состав различных пластиков, стоматологических герметиков и композитов [North, Halden, 2013]. Было показано, что наномолярные концентрации БФА ускоряют развитие эмбрионов на стадии восьми клеток и стадии бластоцисты, тогда как более высокие дозы действуют противоположным образом [Takai et al., 2000; Takai et al., 2001]. Кроме того, воздействие БФА в эмбриональный период вызывает во взрослом организме широкий спектр вредных эффектов, включая ожирение, ухудшение половой дифференциации, нарушение развития мозга [Паткин и др., 2012; Паткин, Софронов, 2015].

Вопрос о молекулярных механизмах, посредством которых БФА может оказывать негативное влияние на организм человека и животных, остается открытым. Общепризнано, что БФА действует одновременно в качестве эндокринно-активного соединения и как агент, который влияет на метилирование ДНК. Оба механизма не являются взаимоисключающими, хотя эпигенетические механизмы действия БФА изучены очень плохо [Паткин, Софронов, 2015; Thayer, Belcher, 2011; Acconcia et al., 2015]. Предполагается, что при воздействии БФА в пренатальном периоде развития организма происходят разного рода нарушения метилирования ДНК, приводящие к изменению эпигенетического статуса эмбриона. Такие изменения в процессе развития зародышей и клеточной дифференцировки, устойчиво изменяя эпигеном, могут вызвать патологические изменения фенотипа потомства [Kundakovic, Champagne, 2011; Kundakovic et al., 2013; Santangeli et al., 2017].

В связи с вышесказанным цель данной работы состояла в количественной оценке полногеномного метилирования ДНК у мышей на 12 день эмбрионального развития, подвергшихся воздействию различных доз БФА на всем протяжении доимплантационного периода.

Материалы и методы

Все работы с Mus musculus проводились в соответствии с требованиями этического комитета по уходу и использованию лабораторных животных, принятыми и обнародованными ФГБНУ «ИЭМ». До начала опытов 8-10-недельные мыши-гибриды F1 (CBAхC57BL) из питомника «Рапполово» (Санкг- Петербург) около 2 недель содержались при инвертированном световом режиме, темный период продолжался 8 часов. При таком световом режиме овуляция яйцеклеток у самок синхронизируется. Для получения большего количества зародышей самки подвергались гормональной стимуляции. Суперовуляцию у самок вызывали инъекцией 5 ед. сывоpоточного ганадотpопина («Folligon») и через 48 ч - 5 ед. хорионического гонадотpопина («Сhorulon»). Самок подсаживали к самцам на ночь и утром следующего дня проверяли наличие копулятивной пробки. День обнаружения пробки принимали за первый день беременности. Всех беременных самок делили на три группы: первая группа - чистый контроль (интактная); второй группе животных в течение 4 дней внутрибрюшинно вводили кунжутное масло («Inaxllc»), содержащее разные дозы диметилсульфоксида («Sigma-Aldrich») (условное обозначение группы «ДМСО»); третьей группе мышей также в течение 4 дней внутрибрюшинно вводили 0,1мл раствора, содержащего разные дозы ДМСО и бисфенола А («Sigma-Aldrich») в кунжутном масле (условное обозначение группы

«ДМСО-БФА»). Растворы на основе кунжутного масла и ДМСО в разных концентрациях были использованы в качестве растворителя БФА. Животных забивали дислокацией шейных позвонков на 12 день беременности и эмбрионы из матки переносили в раствор 1хPBS. Для дальнейшего молекулярно- генетического исследования каждый эмбрион условно делили на три части: «Головной мозг», «Брюшной отдел» (внутренние органы), «Спинной отдел» (грудной и пояснично-крестцовый отдел позвоночника).

В группе «Контроль-интактный» были исследованы образцы ДНК от 29 эмбрионов, в группах «Контроль-ДМСО 0.004%», «Контроль-ДМСО 0.1%» и «Контроль-ДМСО 1%» - по 20 эмбрионов. В группе «БФА 10 мкг-ДМСО 0.004%» исследованы образцы ДНК от 9 эмбрионов, в группе «БФА 4 мкг-ДМСО 0.1%» - от 16 эмбрионов, в группе «БФА 40 мкг-ДМСО 1%» - от 29 эмбрионов.

Выделение геномной ДНК. Геномной ДНК получали с помощью бесфенольной хлороформной экстракции [Сучкова и др., 2016] с последующей обработкой РНКазойА («AppliChem»), следуя рекомендациям производителя. Концентрацию ДНК измеряли спектрофотометрически (спектрофотометр NanoDrop 2000c, «Thermo Scientific») при длинах волн 260 и 280 нм согласно стандартной методике. О степени чистоты препаратов ДНК судили по соотношению оптических плотностей D260/D280 и получаемым с помощью спектрофотометра спектрам. Для последующей работы все исследуемые образцы были стандартизированы по концентрации ДНК (50 нг/мкл).

Метил-чувствительная рестрикция с использованием ImageJ анализа (Methylation Sensitive Restriction-ImageJ Assay, MSR-IA). Данная методика является оптимизированным вариантом [Сучкова и др., 2016] классического биохимического подхода по анализу метилирования ДНК, основанного на чувствительности эндонуклеаз рестрикции к метилированному цитозину [Waalwijk, Flavell, 1978], с использованием современного программного обеспечения ImageJ [Rasband, 1997-2015; Abramoff et al., 2004; Schneider et al., 2012].

Ферментативный гидролиз ДНК проводили с помощью метил-чувствительных эндонуклеаз рестрикции MspI и HpaII, следуя рекомендациям фирмы-производителя ферментов («Thermo Scientific»). Рестрикционная смесь объемом 18 мкл содержала 33 мМ Трис-ацетат (pH 7.9), 10 мМ ацетат магния, 66 мМ ацетат калия, 0.1 мг/мл BSA, ферменты MspI либо HpaII по 10 ед. на 350 нг геномной ДНК. Смесь инкубировали при 370С в течение 5 часов. Для одного и того же исследуемого образца ДНК в опыт брали три варианта: образец с MspI, с HpaII и без добавления ферментов. Последний вариант служил контролем сохранности ДНК в реакционном буфере.

ЭлектрофорезДНКвагарозномгелеиденситометрическийанализэлектрофореграммc помощью программного обеспечения ImageJ. После ферментативного гидролиза ДНК проводили электрофорез в горизонтальных пластинах 1,0 % агарозного геля на 0.5хТВЕ (44,5 мМ Трис; 44,5 мМ борная кислота, рН 8,0; 1 мМ ЭДТА) в течение 50 минут при силе тока 40mA (напряженность электрического поля составляла 5 В/см). В качестве маркера размеров фрагментов ДНК использовали коммерческий образец «kb-ДНК- маркер» («СибЭнзим»). ДНК визуализировали окрашиванием бромистым этидием (1 мкг/мл) в течение 15 минут. Просмотр геля осуществляли с помощью УФ-трансиллюминатора и фотографировали на цифровую камеру. Далее проводили количественный анализ полученных изображений в программе ImageJ.

Для одного и того же исследуемого образца измеряли интенсивность флюоресценции (плотность окраски анализируемой области) «Mean gray value» («MGV») шлейфа фрагментированной ДНК на дорожках после рестрикции MspI и HpaII (по 5 измерений на пробу). Площадь измерений для MspI и HpaII дорожек была одинаковая и включала в себя всю ширину дорожки, начиная с зоны фрагментации геномной ДНК до области нахождения краски для нанесения бромфенолового синего. Значения флуоресценции фона из измерений были исключены. Затем данные измерений «MGV» для "MspI-вариантов" делили на данные измерений «MGV» для "HpaII-вариантов" так получали значения «Relative gray value» («RGV») относительного уровня полногеномного метилирования ДНК по CCGG сайтам, выраженное в условных единицах (у.е.). Для опытных образцов ДНК устанавливали относительный уровень полногеномного метилирования CCGG сайтов, выраженный в процентах, используя коэффициенты уравнения линейной регрессии (Y=a+bX, Y = 397.18081X - 374.48979) (R = 0,9899), полученные на основе 8 стандартных образцов ДНК. В качестве стандартных образцов ДНК с известным уровнем полногеномного метилирования ДНК были использованы образцы коммерческой неметилированной и метилированной ДНК человека («Human methylated and non-methylated DNA Set», «Zymo Research»). Неметилированная форма ДНК получена из клеточной линии HCT116 DKO, которая является генетическим нокаутом по двум ДНК метилтрансферазам (DNMT1 и DNMT3b). ДНК этих клеток имеет низкий уровень метилирования (< 5% CpG) и поэтому часто используется как негативный контроль при анализе метилирования CpG динуклеотидов. Метилированная форма ДНК (100% CpG) этой же клеточной линии получена фирмой- производителем in vitro с помощью CpG-метилазы и служит в качестве позитивного контроля при анализе метилирования CpG динуклеотидов. На основе коммерческой неметилированной и метилированной ДНК был сделана серия стандартных образцов, моделирующих 12.5 %, 37.5 %, 50.0 %, 62.5%, 75.0 %, 87.5 % уровни полногеномного метилирования ДНК.

Статистическаяобработка данных. Статистическую обработку полученных данных проводили с использованием непараметрических критериев Крускала-Уоллиса (Н) и Данна (Q) для попарного сравнения.

Различия    считали    статистически    значимыми    при     p<0,05    (с учетом     поправки    Бонферрони    на множественность сравнений).

Результаты и обсуждение

Проведенный в данной работе анализ показал, что исследованные области тела эмбрионов мыши на 12 день развития имеют разный уровень метилирования ДНК как в норме (интактная группа), так и после воздействия «ДМСО» (рис.1), либо смесью «ДМСО с БФА» (табл. 1). При этом наблюдалась различная эпигеномная реакция на воздействие токсикантов как в зависимости от дозы, так и от исследуемой области тела эмбрионов (гипо- либо гиперметилирование, либо без изменений по сравнению с соответствующим контролем). Так, внутрибрюшинное введение ДМСО беременным самкам мыши в течение всего доимплантационного периода приводило к изменению полногеномного уровня метилирования ДНК у плодов на 12 день эмбрионального развития (Рис. 1).

Обнаружены статистически значимые различия между сравниваемыми выборками «Контроль- интактный» и «ДМСО» в выборке «Брюшной отдел» (H = 26.989,df = 3, p = 0.001) и «Спинной отдел» (H = 62.591,df = 3, p=0.001). Наблюдалось повышение примерно в 1.2 раза уровня метилирования ДНК только в «Брюшном отделе» при введении 1% ДМСО (Q=5.042, к=4, p=0.01) и в «Спинном отделе» при введении 0.004% ДМСО (Q=5.091, к=4, p=0.01), 0.1% ДМСО (Q=4.992, к=4, p=0.01) и 1% ДМСО (Q=6.718, к=4, p=0.01), тогда как в «Головном мозге» статистически значимых различий по сравнению с интактным контролем обнаружено не было. Особо следует подчеркнуть, что в норме (интактный контроль) в «Головном мозге» ДНК была более метилирована, чем в «Брюшном» и «Спинном» отделах.

Данные по анализу метилирования ДНК у эмбрионов, подвергшихся внутриутробно воздействию различных доз БФА представлены в таблице 1. Было обнаружено, что по сравнению с контролем «0.004% ДМСО» введение БФА в дозе 10мкг/мышь снижает уровень полногеномного метилирования ДНК примерно в 1.2 раза в «Головном мозге» и в 1.4 раза в «Спинном отделе», тогда как доза 4 мкг/мышь не изменяет метилирование в «Головном мозге», но в 1.3 раза снижает метилирование в «Спинном отделе» и во столько же раз повышает его в «Брюшном отделе» по сравнению с соответствующим контролем «0.1% ДМСО». Доза БФА 40 мкг/мышь также не изменяет метилирование в «Головном мозге», но в тоже время понижает уровень метилирования ДНК примерно в 1.3 раза в «Брюшном» и «Спинном» отделах по сравнению с соответствующим контролем «1% ДМСО».

Таблица 1. Относительный уровень полногеномного метилирования ДНК по CCGG сайтам в разных частях тела у мышей на 12 день эмбрионального развития после воздействия разными дозами БФА и ДМСО.

Примечание: данные представлены как медиана и среднее абсолютное отклонение медианы (average absolute deviation from median); Q - критерий Данна; р – уровень значимости (при к = 2, где к - число сравниваемых групп).

В ряде работ также отмечалось, что воздействие БФА на беременных самок мышей приводит к снижению уровня метилирования ДНК, а именно к гипометилированию IAP генов (Avy и CapbIAP) [Dolinoy et. al., 2007] и импринтированных генов Igf2r, Peg3 и H19 [Chao et.al., 2012; Zhang et al., 2012]. Значительное снижение уровня полногеномного метилирования ДНК в сочетании с уменьшением экспрессии Dnmt1 было обнаружено в семенниках и яичниках у рыб Danio rerio (Zebrafish) после воздействия

1.1    мг/л БФА [Laing et al., 2016]. В некоторых случаях БФА вызывал повышение уровня метилирования ДНК. Так, гиперметилированная ДНК была найдена в ткани хвоста потомков мыши, перинатально подвергнутой воздействием очень низких (5 нг/кг) доз БФА [Singh, Li, 2012]. Было показано, что воздействие БФА во время беременности (у мышей и крыс) может индуцировать в мозге у потомков первого поколения в пубертатном возрасте доза-зависимые, зависимые от пола и район-специфичные (по отделам мозга) изменения в экспрессии генов, кодирующих эстрогеновые рецепторы. При этом параллельно с изменениями метилирования генов эстроген-ассоциированных рецепторов наблюдались изменения в уровне мРНК ДНК- метилтрансфераз DNMT1 и DNMT3A в ювенильной коре у самцов и гипоталамусе у самок [Kundakovic et al., 2013]. Таким образом, все эти данные указывают на важность исследований эпигеномных и эпигенетических эффектов воздействия БФА на здоровье человека и животных.

Заключение

Проведенное исследование показало, что воздействие бисфенола А на беременных самок в течение всего доимплантационного развития (4 суток) влияет на уровень полногеномного метилирования ДНК у эмбрионов. Головной мозг оказался более чувствительным к дозе БФА 10 мкг/мышь (наблюдалось гипометилирование), органы брюшной полости оказались чувствительны к дозам БФА 4 мкг/мышь (наблюдалось гиперметилирование) и 40 мкг/мышь (наблюдалось гипометилирование), а в грудном и пояснично-крестцовом отделах позвоночника наблюдалась эпигеномная реакция (гипометилирование) на воздействие всех трех исследованных доз БФА. Кроме того, было обнаружено, что грудной и пояснично- крестцовый отдел позвоночника более чувствительны к воздействию различных доз ДМСО, чем головной мозг и органы брюшной полости.

Описанный в данной работе метод может быть использован в практической медицине и ветеринарии для выявления эпигеномных нарушений при различных патологиях и воздействиях экотоксикантов.

*Работа поддержана грантом РФФИ №15-04-04642а

Список литературы

1.        Паткин Е.Л., Павлинова Л.И., Софронов Г.А. Влияние экотоксикантов на эмбриогенез и гаметогенез млекопитающих. Эпигенетические механизмы // Биосфера. 2012. Т.5. № 4. С.450- 472.

2.        Паткин Е.Л., Софронов Г.А. Эколого-зависимые заболевания человека. Эпигенетические механизмы возникновения и наследования // Медицинский академический журнал. 2015. Т.15.№ 3. с. 7-23.

3.        Сучкова И.О., Дергачева Н.И., Павлинова Л.И., Сасина Л.К., Баранова Т.В., Паткин Е.Л. Количественное определение полногеномного метилирования ДНК с помощью метил- чувствительной рестрикции и IMAGEJ анализа (MSR-IA) // Межд. науч.-исслед. журнал. 2016.Т. 4-5 (46). С. 41-46.

4.        Abramoff M.D., Magalhaes P.J., Ram S.J. Image Processing with ImageJ // Biophotonics International. 2004. V. 11(7). P. 36-42.

5.        Acconcia F., Pallottini V., Marino M. Molecular Mechanisms of Action of BPA // Dose-Response: An International Journal. 2015. P. 1-9.

6.        Chao H-H., Zhang X-F., Chen B., Pan B., et al.        Bisphenol A exposure modifes methylation of imprinted genes in mouse oocytes via the estrogen receptor signaling pathway // Histochem. Cell Biol. 2012. V. 137. P. 249-259.

7.        Dolinoy D.C., Huang D., Jirtle R.L. Maternal nutrient supplementation counteracts bisphenol A- induced DNA hypomethylation in early development // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2007. V. 104. P. 13056-13061.

8.     Kundakovic M., Champagne F.A. Epigenetic perspective on the developmental effects of bisphenol A // Brain Behav Immun. 2011. V.25. P.1084-1093.

9.        Kundakovic M., Gudsnuk K., Franks B., Madrid J., Miller R.L., Perera F.P., Champagne F.A. Sex- specific epigenetic disruption and behavioral changes following low-dose in utero bisphenol A exposure // PNAS. 2013. V. 110(24). P. 9956-9961.

10.     Laing L. V., Viana J., Dempster E. L., Trznadel M., et al. Bisphenol A causes reproductive toxicity, decreases dnmt1 transcription, and reduces global DNA methylation in breeding zebrafish (Danio rerio) // Epigenetics. 2016. V. 11(7) 526-538.

11.     North E.J., Halden R.U. Plastics and environmental health: the road ahead // Rev Environ Health. 2013. V.28. P.1-8.

12.     Rasband W.S., ImageJ U. S. National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA, 1997-2015 (http://imagej.nih.gov/ij).

13. Santangeli S., Maradonna F., Olivotto I., et al. Effects of BPA on female reproductive function: The involvement of epigenetic mechanism // Gen Comp Endocrinol. 2017. V.245. P. 122-126.

14.     Schneider C.A., Rasband W.S., Eliceiri K.W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis // Nature Methods. 2012. V. 9. P. 671-675.

15.     Singh S., Li S.S-L. Epigenetic effects of environmental chemicals bisphenol A and phthalates // Int. J. Mol. Sci. 2012. V. 13. P. 10143-10153.

16.     Takai Y., Tsutsumi O., Ikezuki Y. et al. Estrogen receptor-mediated effects of a xenoestrogen, bisphenol A, on preimplantation mouse embryos // Biochem BiophysRes Commun. 2000. V.270. P. 918-921.

17.     Takai Y., Tsutsumia O., Ikezukic Y. et al. Preimplantation exposure to bisphenol A advances postnatal Development // Reprod Toxicol. 2001. V.15. P. 71-74.

18.     Thayer K. A., Belcher S. Mechanisms of action of bisphenol A and other biochemical/molecular interactions // FAO/WHO expert meeting on bisphenol A (BPA) Ottawa, Canada, 2-5 November 2010, World Health Organization, 2011. 10 p.

19.     Waalwijk С., Flavell R.A. MspI an isoschizomer of HpaII which cleaves both unmethylated and methylated HpaII sites // Nucleic Acids Res. 1978. V. 5. P. 3231-3236.

20.     Zhang C., Li R., Zhao R. A semi-quantitative assay of overall DNA methylation status using Methyl- CpG binding protein (MBD1) // BMC Research Notes. 2012. V. 5. P. 234.