ИЗМЕНЕНИЕ СТЕПЕНИ КОМПАКТИЗАЦИИ ХРОМАТИНА В КЛЕТОЧНЫХ ЛИНИЯХ ЧЕЛОВЕКА HepG2, IMR32 И FetMSC ПРИ ВОЗДЕЙСТВИИ РАЗЛИЧНЫХ ДОЗ ХЛОРИДА КАДМИЯ

Введение

В последнее десятилетие интенсивно изучается взаимосвязь между возникновением заболеваний и загрязнением окружающей среды тяжелыми металлами, в частности соединениями кадмия, которые широко используются в ювелирной промышленности и при изготовлении игрушек, для производства неорганических пигментов, а также входят в состав антикоррозийных покрытий, электронных устройств и никель-кадмиевых батарей. Кадмий попадает в окружающую среду при сжигании бытовых отходов, угля, дизельного топлива, бензина и других видов ископаемого топлива, является побочным продуктом добычи, выплавки и рафинирования цинка, свинца и медных руд. Этот токсичный металл присутствует в сигаретном дыму, питьевой воде и продуктах питания. Высокие концентрации ионов кадмия накапливаются в растениях (особенно зеленые листовые овощи и корнеплоды), морепродуктах животного происхождения, мясе птиц и млекопитающих. [Jarup, Akesson, 2009; Ray et al, 2014].

В настоящее время кадмий классифицируется как канцероген группы I, связанный с развитием рака печени, костей, почек и поджелудочной железы. Кроме того, соединения кадмия являются фактором риска развития болезней нервной, сердечно-сосудистой, дыхательной и иммунной систем. Вредное воздействие кадмия может приводить к нарушениям опорно-двигательного аппарата, репродуктивных функций и задержкам развития [Малов и др., 2013; Jarup et al., 1998; Fowler, 2009; Verma et al., 2011; Kippler et al., 2012; Tellez-Plaza et al., 2012; Pacchierotti, Spano, 2015].

Предполагается, что изменения в окислительно-восстановительном статусе клеток, вызванные ионами кадмия, нарушают репарацию ДНК и экспрессию генов на транскрипционном и посттранскрипционном уровнях, в том числе затрагиваются и эпигенетические механизмы регуляции активности генов на уровне метилирования ДНК и компактизации хроматина. Обнаружено, что кадмий может нарушать модификацию гистонов, приводить как гипо-, так и гиперметилированию ДНК в зависимости от дозы и продолжительности воздействия [Takiguchi at al.,, 2003; Gadhia et al, 2012; Паткин, Софроновя, 2015]. Следует отметить, что во всем мире активно проводятся исследования молекулярных механизмов эпигенетических и эпигеномных нарушений и их роли в развитии патологий человека и животных, вызванных воздействием кадмия, однако до сих пор многие вопросы в этой области остаются открытыми. В связи с этим в данной работе был проведен сравнительный анализ влияния низких доз хлорида кадмия на степень полногеномной компактизации хроматина в культурах клеток человека разного происхождения.

Материалы и методы

Были исследованы три линии клеток человека: эпителиоподобная HepG2 (гепатоцеллюлярная карцинома), фибробласто- и нейробластоподобная IMR32 (нейробластома), фибробластоподобная FetMSC (мезенхимальные стволовые клетки костного мозга 5-6 недельного эмбриона) (Российская коллекция клеточных культур Института цитологии Санкт-Петербург) [Полянская и др. РККК].

Культивированиемонослойныхклеточныхлинийчеловека. Все клетки культивировали при 370С в СО2-инкубаторе в атмосфере 5 % CO2   в 25 см2- культуральных вентилируемых флаконах («Jet Biofil») в среде DMEM (для FetMSC в DMEM/F12) с добавлением 10% эмбриональной бычьей сыворотки («Биолот»), 20 ед/мл антимикотиков («Gibco»), 100 ед/мл пенициллина («Биолот») и 100 мкг/мл стрептомицина («Биолот») в течение 24 часов до достижения клетками 25-30% конфлюентности. Затем в опытные образцы добавляли хлорид кадмия (конечные концентрации 0,5 мкМ, 1 мкМ, 2 мкМ, 5 мкМ, 10 мкМ) и продолжали культивирование еще в течение 72 часов. Контрольные образцы без CdCl2 также культивировали еще в течение 72 часов. Снятие культуры клеток проводили с помощью раствора трипсин-Версена (1:3), суспензию клеток переносили в пробирки для последующего выделения ядер. Для каждой линии клеток было проведено не менее трех независимых опытов.

Получение и обработка ядер ДНКазой I. Для получения ядер из исследуемых клеточных культур суспензию клеток центрифугировали при 800g 5 мин. Надосадочную жидкость полностью удаляли и добавляли теплый гипотонический раствор (0.50% KCl), который составлял 7-10 объёмов от размера осадка. Клетки ресуспендировали и инкубировали при 370С в течение 30 мин. Центрифугировали при 1000g 5 мин. Гипотонический раствор удаляли и осадок ядер ресуспендировали в 30-50 мкл 1х PBS. Концентрацию ядер оценивали с помощью камеры Горяева (в среднем концентрация ядер была 103 – 105/мкл). Суспензию хранили при -20 0С.

Определение относительной степени полногеномной компактизации хроматина с помощью ДНКазы  I и ImageJ анализа (Genome-wide Chromatin State DNaseI Sensitive Assay, GWChS-DNase-SA). Данная методика является модифицированным вариантом классического биохимического подхода, основанного на чувствительности ДНК к ДНКазе I [Кирьянов, 1983; Ling, Waxman, 2013], с использованием современного программного обеспечения ImageJ [Rasband, 1997-2015; Abramoff et al., 2004; Schneider et al., 2012]. Обработку хроматина (~104 ядер/проба) ДНКазой I проводили в 30 мкл реакционной смеси (10 mМ Tris-HCl, pH 7.5 при 250С; 2.5 mМ MgCl2; 0.1 mМ СaCl2; 0,009 ед/мкл ДНКаза I) («Thermo Scientific») в течение 5 минут при +150С. Для одного и того же исследуемого образца ядер в опыт брали два варианта: проба с ДНКазой I и проба без фермента. Контролем полноты обработки ДНКазой I служил образец ДНК соответствующей клеточной линии (в количестве 1000 нг/проба). Реакцию останавливали добавлением 1/10 объема 0.5 М ЭДТА и инкубировали во льду в течение нескольких минут. Затем из этих образцов выделяли ДНК с помощью протеиназной обработки и однократной депротеинизацией раствором хлороформ:изоамиловый спирт (24:1, v/v). Верхнюю фазу, содержащую нуклеиновые кислоты, переносили в новую центрифужную пробирку и добавляли РНКазуА (конечная концентрация 8 мг/мл). Инкубировали при +370С в течение 60 минут. Далее следовала стандартная процедура осаждения ДНК с помощью этанола. Осадок ДНК высушивали в термостате при +370С в течение 30 - 60 минут. ДНК растворяли в 18 мкл бидистиллированной воды.

ЭлектрофорезДНКвагарозномгелеиденситометрическийанализэлектрофореграммc помощью программногообеспеченияImageJ. Электорофорез образцов ДНК после обработки ДНКазой I проводили в горизонтальных пластинах 1,0 % агарозного геля на 0.5хТВЕ (44,5 мМ Трис; 44,5 мМ борная кислота, рН 8,0; 1 мМ ЭДТА) в течение 50 минут при силе тока 40mA (напряженность электрического поля составляла 5 В/см). ДНК визуализировали окрашиванием бромистым этидием (1мкг/мл) в течение 15 минут. Просмотр геля осуществляли с помощью УФ-трансиллюминатора и фотографировали на цифровую камеру. Далее проводили количественный анализ полученных изображений с помощью программы ImageJ, где для одного и того же исследуемого образца измеряли интенсивность флюоресценции «шлейфа» ДНК на дорожках для вариантов после обработки ДНКазой I («DNaseI») и в буфере без фермента («buffer»). Площадь измерений для всех проб была одинаковая и включала в себя всю ширину дорожки, начиная с зоны внесения (лунка) геномной ДНК в гель до области нахождения краски для нанесения бромфенолового синего. Значения флуоресценции фона из измерений были исключены. Относительные значения степени компактизаци хроматина получали отношением абсолютных значений для лунки «DNaseI» к значению для «buffer». Для каждой дорожки делали по 5 измерений. Затем для опытных образцов с неизвестной степенью компактизации хроматина устанавливали относительный уровень гетерохроматинизации, выраженный в процентах, используя коэффициенты уравнения линейной регрессии (y=a+bX), полученные по опорным точкам для 0% гетерохроматина (для этого служили значения «голой» ДНК по 8 экспериментам) и 100% гетерохроматина (1 у.е. флуоресценции ImageJ). Стандартная ошибка для исследуемого образца вычислялась по формуле σ/√N, где N - количество образцов «голой» ДНК, использованных при построении уравнения линейной регрессии; σ-погрешность предсказания формулы.

Статистическаяобработка данных. Статистическую обработку полученных данных проводили с использованием непараметрических критериев Крускала-Уоллиса (Н) и Данна (Q) для попарного сравнения с контрольной группой. Различия считали статистически значимыми при p<0,05 (с учетом поправки Бонферрони на множественность сравнений).

Результаты и обсуждение

Хлорид кадмия одно из легкорастворимых соединений этого тяжелого металла, который приводит к эпигенетическим и эпигеномным изменениям в клетках позвоночных при различных дозах и продолжительности воздействия. В представленной работе на трех культурах клеток человека разного типа был исследован характер влияния низких доз CdCl2 на структуру хроматина при его кратковременном (в течение 72 часов) воздействии. C помощью метода GWChS-DNase-SA была проведена полуколичественная оценка степени полногеномной компактизации хроматина в линиях HepG2, IMR32 и FetMSC. Было обнаружено, что CdCl2 в основном приводит к снижению степени компактизации хроматина (в 1.2 – 1.8 раза в зависимости от линии клеток и дозы токсиканта), причем в линиях IMR32 и FetMSC это воздействие характеризуется колебательной картиной влияния доза-эффект, а именно наблюдаются пики перехода от «эухроматинизации» к «гетерохроматинизации», а затем опять возвращение к «эухроматинизации» (Рис.1). Необходимо отметить, что только в случае дозы 2 мкМ CdCl2 и только для линии IMR32 наблюдалось повышение (примерно в 1.4 раза) степени компактизации хроматина по сравнению с контролем.

В настоящее время есть ряд публикаций, где представлены результаты исследования влияния CdCl2 на культуре клеток HepG2, но нет данных на линиях IMR32 и FetMSC, но есть работы на других линиях мезенхимальных стволовых клеток и клетках нейронального происхождения. Так, было обнаружено, что в клетках HepG2 низкие дозы CdCl2 приводят к изменению уровня экспрессии ряда генов в зависимости от дозы и продолжительности воздействия, при этом наблюдались изменения в уровне miРНК и степени компактизации хроматина [Fabbri et al., 2012; Olszowski et al., 2012; Cartularo et al., 2015]. Культивирование in vitro олигодендроцитов течение 48 часов в присутствии низких доз CdCl2 (0.001 - 25 мкM) приводило к значительному снижению метаболической активности митохондрий и апоптозу клеток. В культивируемых эндотелиальных клетках мозга мыши и нейрональной линии HT4 мыши после 24 часов воздействия низкими дозами (от 15 до 45 мкМ) CdCl2 происходило 360-кратное повышение синтеза простагландина Е2, тогда как через 48 часов воздействия его синтез значительно снижался [Olszowski et al., 2012; Wang, Du, 2013]. Воздействие 0.1 мкМ CdCl2 в течение 48 часов приводило к повреждению митохондрий в гематопоэтических стволовых клетках костного мозга человека и окислительному стрессу в недифференцированных стволовых клетках [Templeton, Liu, 2010; Nair et al., 2013]. Однако опубликованных данных об эпигенетических и эпигеномных изменениях в нейробластомных и мезенхимальных стволовых клетках при воздействии CdCl2 пока нет.

Заключение. Низкие дозы (0.5 – 10 мкМ) хлорида кадмия влияют на структуру хроматина эукариотических клеток. Воздействие этого экотоксиканта в течение 72 часов в клеточных линиях человека HepG2, IMR32 и FetMSC преимущественно приводит к снижению степени полногеномной компактизации хроматина, т.е. происходит эухроматинизация, что в свою очередь может приводить к активации генов, которые ранее находились в репрессированном состоянии.

*Работа поддержана грантом РФФИ №15-04-04642а

Список литературы

1.        Кирьянов Г.И. Структура хроматина и энзиматическое метилирование ДНК. Диссертация на соискание ученой степени д.б.н., Москва. 1983, 258с.

2.        Малов А.М., Сибиряков В.К., Иваненко А.А. Накопление кадмия в некоторых органах и тканях крыс // Клиническая токсикология. 2013. Т.14. с.228-240.

3.        Паткин Е.Л., Софронов Г.А. Эколого-зависимые заболевания человека. Эпигенетические механизмы возникновения и наследования // Медицинский академический журнал. 2015. Т.15. № 3. с. 7-23.

4.        Полянская Г.Г., Сакута Г.А., Еропкин М.Ю., Смирнова Т.Д., Подчерняева Р.Я., Михайлова Г.Р., Дьяконов Л.П., Гальнбек Т.В., Глинских Н.П., Бахарев А.А. Российская коллекция клеточных культур позвоночных (РККК П) Санкт-Петербург, ЦИН РАН, 155 с.

5.        Abramoff M.D., Magalhaes P.J., Ram S.J. Image Processing with ImageJ // Biophotonics International. 2004. V. 11(7). P. 36-42.

6.        Cartularo L., Laulicht F., Sun H., Kluz T., Freedman J.H., Costa M. Gene expression and pathway analysis of human hepatocellular carcinoma cells treated with cadmium // Toxicology and Applied Pharmacology. 2015. V. 288. P. 399-408.

7.        Fabbri M., Urani C., Sacco M.G., Procaccianti C., Gribaldo L. Whole genome analysis and microRNAs regulation in HepG2 cells exposed to cadmium // ALTEX. 2012. V. 29(2). P. 173-182.

8.        Fowler B.A. Monitoring of human populations for early markers of cadmium toxicity // Toxicol. Appl. Pharmacol. 2009. V. 238. P. 294-300.

9.        Gadhia S.R., Calabro A.R., Barile F.A. Trace metals alter DNA repair and histone modification pathways concurrently in mouse embryonic stem cells / S.R. Gadhia, A.R. Calabro, F.A. Barile // Toxicol Lett. 2012. V. 212(2). P. 169- 179.

10.     Jarup K., Alfen T., Perrson B., Toss G., Elinder C. Cadmium may be a risk factor for osteoporosis // Occup. Environ. Med. 1998. V.55. P. 435-43.

11.     Jarup L., Akesson A. Current status of cadmium as an environmental health problem / // Toxicol Appl Pharmacol. 2009. V. 238. P. 201-208.

12.     Kippler M., Tofail F., Gardner R., Rahman A., Hamadani J.D., Bottai M., Vahter M. Maternal cadmium exposure during pregnancy and size at birth: a prospective cohort study // Environ. Health Perspect. 2012. V. 120. P. 84-289.

13.     Ling G., Waxman D.J. DNase I digestion of isolated nulcei for genome-wide mapping of DNase hypersensitivity sites in chromatin // in Gene Regulation: Methods and Protocols, Methods in Molecular Biology / ed. Minou Bina, 2013. V. 977. Chap.3. P.21-34.

14.     Nair A.R, DeGheselle O., Smeets K., Kerkhove E.V., Cuypers A. Cadmium-Induced Pathologies: Where Is the Oxidative Balance Lost (or Not)? // Int. J. Mol. Sci. 2013. V. 14. P. 6116-6143.

15.     Olszowski T., Baranowska-Bosiacka I., Gutowska I., Chlubek D. Pro-inflammatory properties of cadmium // Acta Biochimica Polonica. 2012. V. 59 (4). P. 475-482.

16.     Pacchierotti F., Spano M. Environmental Impact on DNA Methylation in the Germline: State of the Art and Gaps of Knowledge // Biomed Res Int. 2015. V. 2015. P. 23.

17.     Rasband W.S., ImageJ U. S. National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA, 1997-2015 (http://imagej.nih.gov/ij).

18.     Ray P.D., Yosim A.,.  Fry R.C. Incorporating epigenetic data into the risk assessment process for the toxic metals arsenic, cadmium, chromium, lead, and mercury: strategies and challenges // Front Genet. 2014. V. 5. P. 201.

19.     chneider C.A., Rasband W.S., Eliceiri K.W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis // Nature Methods. 2012. V. 9. P. 671-675.

20.     Takiguchi M., Achanzar W.E., Qu W., Li G., Waalkes M.P. Effects of cadmium on DNA-(Cytosine-5) methyltransferase activity and DNA methylation status during cadmium-induced cellular transformation // Experimental Cell Research. 2003. V. 286. P. 355-365.

21.     Tellez-Plaza M., Navas-Acien A., Menke A., Crainiceanu C.M., Pastor-Barriuso R., Guallar E. Cadmium exposure  and all-cause  and cardiovascular mortality in the U.S.  general population // Environ. Health Perspect. 2012. V. 120. P. 1017-1022.

22.     Templeton D.M., Liu Y. Multiple roles of cadmium in cell death and survival // Chem. Biol. Interact. 2010. V. 188. P. 267-275.

23.     Verma R, Xu X., Jaiswal M.K., Olsen C., Mears D., Caretti G., Galdzicki Z. In vitro profiling of epigenetic modifications underlying heavy metal toxicity of tungsten-alloy and its components // Toxicol. Appl. Pharmacol. 2011. V. 253. P. 178-187.

24.     Wang B., Du Y. Cadmium and Its Neurotoxic Effects // Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2013. V. 2013. P.12.